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Study of the self-assembly of the pro-inflammatory S100A9 protein driven by metal ion binding

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A causa de doenças neurodegenerativas está muitas vezes associada à formação de agregados proteicos e estruturas amilóides. Um exemplo mais representativo desta situação é a doença de Alzheimer, que se caracteriza pela existência de um cenário de neuro-inflamação e amiloidogénese. Neste contexto biológico, ocorre a acumulação do péptido β-amilóide (Aβ) em placas extracelulares e a deposição da proteína tau na forma híper-fosforilada em emaranhados neurofibrilares intracelulares. Como consequência deste fenómeno, o principal sintoma da doença é a deterioração das capacidades cognitivas, porém, os mecanismos subjacentes a estes sintomas não são ainda totalmente compreendidos. Além disso, a desregulação da homeostase dos metais é também observada em pacientes que sofrem desta patologia. A proteína S100A9 tem vindo a ser frequentemente associada com a doença de Alzheimer devido ao seu papel tanto como agente pro-inflamatório e amiloidogénico. A S100A9, também conhecida como Mrp14, pertence à grande família das proteínas S100, as quais possuem dois domínios EF-hand de ligação a cálcio (Ca2+), ligando também zinco (Zn2+) e cobre (Cu2+) em locais distintos dos locais de ligação do Ca2+. Esta proteína é uma das mais potentes proteínas pro-inflamatórias da família S100, sendo sobrexpressa em cenários inflamatórios, incluindo a inflamação decorrente na doença de Alzheimer. Estudos prévios demonstraram que a proteína S100A9 tem a capacidade de se reorganizar-se (self-assembly) em dímero, tetrâmero e também em estruturas oligoméricas maiores, onde se inclui a formação de fibras amilóides, como resultado da sua amiloidogenicidade inerente. Deste modo, sabendo que esta proteína tem a capacidade de ligar Ca2+ e Zn2+, e que, por sua vez, a ligação dos metais a proteínas é um fenómeno que induz alterações conformacionais na estrutura das mesmas, foi proposto que a interacção entre a proteína S100A9 e os iões metálicos pode ser a causa da agregação amilóide e da citotoxidade que advém deste fenómeno. Assim, neste estudo são dadas evidências de como os metais influenciam a reacção de self-assembly da proteína S100A9, através do uso de técnicas complementares, nomeadamente espectroscopia de fluorescência recorrendo ao uso de diferentes sondas conformacionais (ThT, ANS, LCOs: p-FTAA e h-FTAA), ensaios de turbidimetria, uso de anticorpos conformacionais (OC e A11), análise por cromatografia de exclusão molecular e também microscopia de força atómica (AFM). Numa primeira parte deste estudo, foi necessário expressar e purificar o homodímero da proteína S100A9 de modo a serem obtidas quantidades significantes de proteína pura, para que os subsequentes ensaios pudessem ser efectuados. Para tal, a proteína recombinante humana foi expressa em E.coli, seguindo-se uma sequência de etapas, que permitiram isolar os corpos de inclusão e extrair as proteínas contidas nestes, incluindo a proteína em estudo. O extracto proteico foi após submetido a uma serie cromatografias: cromatografia de dessalinização, para remover o cloreto de guanidina (agente desnaturante), cromatografia de exclusão molecular e cromatografia de troca-iónica. Finalmente, e dado que o principal objectivo deste estudo era avaliar o efeito dos iões metálicos (Ca2+ e Zn2+) na proteína S100A9, foi necessário desmetalar a proteína pura obtida. Para tal, o extracto foi incubado com DTT e EDTA, seguindo-se nova cromatografia de exclusão molecular, de modo a obter a forma pura final da proteína desmetalada. Neste estudo, demonstramos que o Zn2+ tem a capacidade de induzir a agregação da proteína S100A9, quando presente em concentrações superiores à capacidade da sua ligação à proteína S100A9 e quando esta última está presente numa concentração superior a 10μM (concentração critica para agregar). Os agregados formados apresentaram reactividade para com a sonda ThT (usada para detetar estruturas amilóides) e foram visíveis, macroscopicamente, sob a forma de um precipitado branco, conferindo um aspecto turvo, que possibilitou seguimento deste fenómeno por ensaios onde monitorizou a turbidez da solução a 360 nm. A formação deste precipitado ocorreu numa escala de tempo de minutos. Além disso, observou-se que o aumento da quantidade de Zn2+ se correlacionou com um potenciamento do processo de agregação, onde se observou um aumento do sinal em ambos os ensaios (fluorescência e turbidez) e diminuição da fase de inicial (lag phase). Os resultados com as outras sondas conformacionais mostraram estar de acordo com a existência desta agregação. No entanto, apesar de os agregados formados levarem à formação de espécies reactivas à ThT e aos LCOs, os resultados obtidos através de ensaios de seeding, análise por AFM e detecção com os anticorpos conformacionais, OC e A11, sugerem que os agregados formados não são de origem amilóide, mas por outro lado que parecem ser maioritariamente de natureza amorfa. A divergência de resultados pode ser devida ao facto da sonda ThT ter já ter mostrado capacidade de se ligar não só a estruturas amilóides mas também de outra natureza. A possibilidade de estes agregados serem induzidos por interações electrostáticas que afectam a solubilidade da proteína foi excluída, uma vez que as cinéticas de S100A9 em presença de excesso de NaCl não conseguiram reproduzir o mesmo efeito que o Zn2+. Por último, a análise das amostras de S100A9 incubadas com Zn2+ (razão 4:1), por cromatografia de exclusão molecular, foi possível observar a presença de espécies com um tamanho semelhante ao da proteína S100A9 na sua forma tetramérica, o que está concordante com o ensaio de AFM. Estes resultados sugerem que o Zn2+ induz a formação de agregados não amilóides, que precipitam, com um possível papel na quelação do Zn2+. Relativamente ao efeito do Ca2+, sendo este um ligando natural da proteína S100A9, seria expectável que a ligação deste ião metálico não induzisse a agregação amilóide da proteína. De facto, os ensaios de cinética de ligação das várias sondas conformacionais e de imunodetecção pelos anticorpos OC e A11, excluíram a existência de formação de estruturas amilóides. Em concordância, as imagens obtidas por AFM indicam a ocorrência de uma reacção de polimerização do tipo não-amilóide, onde a proteína S100A9 adquire uma aparência semelhante longas “cordas”. Curiosamente, um ensaio controlo usando a forma apo da proteína S100A9, revelou a formação de estruturas semelhantes, mesmo sem a adição de iões metálicos. Estas evidências sugerem uma possível função biológica destes agregados. Curiosamente, quando combinada a ligação de Zn2+ e Ca2+ à S100A9 observou-se um efeito aditivo que se refletiu numa agregação heterogénea, com presença de fibras amilóides e outros agregados intermediários passiveis de serem observados por AFM e de serem detectados pelos anticorpos conformacionais OC e A11. Além disso, todas as sondas mostram reactividade para com a S100A9, mas de uma forma sequenciada, demostrando a complexidade deste fenómeno. Neste caso, à semelhança da agregação induzida apenas pelo Zn2+, a solução tornou-se túrbida com formação de precipitado branco. Por fim, é de salientar que foram efectuados ensaios com EDTA, um agente quelante, para remover os iões metálicos ligados à S100A9 com o objectivo de verificar a dependência dos agregados formados. Assim, foi observada a reversão da reacção de self-assembly pelo desaparecimento da turbidez, diminuição da fluorescência da ThT e diminuição dos oligómeros/estruturas observadas por AFM. Em suma, este estudo contribuiu para revelar possíveis mecanismos, pelos quais a ligação de Zn2+ e/ou Ca2+ à proteína S100A9 influencia a sua reacção de self-assembly. Abrindo, assim, caminho para investigação dos papéis dos vários agregados em condições patológicas, nomeadamente na doença de Alzheimer, e para evidenciar o papel e a relevância da proteína S100A9 no despoletar da doença.
Autores principais:	Nogueira, Gonçalo Raimundo
Assunto:	S100A9 Agregação proteica Iões metálicos Enrolamento de proteínas Teses de mestrado - 2016
Ano:	2016
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A causa de doenças neurodegenerativas está muitas vezes associada à formação de agregados proteicos e estruturas amilóides. Um exemplo mais representativo desta situação é a doença de Alzheimer, que se caracteriza pela existência de um cenário de neuro-inflamação e amiloidogénese. Neste contexto biológico, ocorre a acumulação do péptido β-amilóide (Aβ) em placas extracelulares e a deposição da proteína tau na forma híper-fosforilada em emaranhados neurofibrilares intracelulares. Como consequência deste fenómeno, o principal sintoma da doença é a deterioração das capacidades cognitivas, porém, os mecanismos subjacentes a estes sintomas não são ainda totalmente compreendidos. Além disso, a desregulação da homeostase dos metais é também observada em pacientes que sofrem desta patologia. A proteína S100A9 tem vindo a ser frequentemente associada com a doença de Alzheimer devido ao seu papel tanto como agente pro-inflamatório e amiloidogénico. A S100A9, também conhecida como Mrp14, pertence à grande família das proteínas S100, as quais possuem dois domínios EF-hand de ligação a cálcio (Ca2+), ligando também zinco (Zn2+) e cobre (Cu2+) em locais distintos dos locais de ligação do Ca2+. Esta proteína é uma das mais potentes proteínas pro-inflamatórias da família S100, sendo sobrexpressa em cenários inflamatórios, incluindo a inflamação decorrente na doença de Alzheimer. Estudos prévios demonstraram que a proteína S100A9 tem a capacidade de se reorganizar-se (self-assembly) em dímero, tetrâmero e também em estruturas oligoméricas maiores, onde se inclui a formação de fibras amilóides, como resultado da sua amiloidogenicidade inerente. Deste modo, sabendo que esta proteína tem a capacidade de ligar Ca2+ e Zn2+, e que, por sua vez, a ligação dos metais a proteínas é um fenómeno que induz alterações conformacionais na estrutura das mesmas, foi proposto que a interacção entre a proteína S100A9 e os iões metálicos pode ser a causa da agregação amilóide e da citotoxidade que advém deste fenómeno. Assim, neste estudo são dadas evidências de como os metais influenciam a reacção de self-assembly da proteína S100A9, através do uso de técnicas complementares, nomeadamente espectroscopia de fluorescência recorrendo ao uso de diferentes sondas conformacionais (ThT, ANS, LCOs: p-FTAA e h-FTAA), ensaios de turbidimetria, uso de anticorpos conformacionais (OC e A11), análise por cromatografia de exclusão molecular e também microscopia de força atómica (AFM). Numa primeira parte deste estudo, foi necessário expressar e purificar o homodímero da proteína S100A9 de modo a serem obtidas quantidades significantes de proteína pura, para que os subsequentes ensaios pudessem ser efectuados. Para tal, a proteína recombinante humana foi expressa em E.coli, seguindo-se uma sequência de etapas, que permitiram isolar os corpos de inclusão e extrair as proteínas contidas nestes, incluindo a proteína em estudo. O extracto proteico foi após submetido a uma serie cromatografias: cromatografia de dessalinização, para remover o cloreto de guanidina (agente desnaturante), cromatografia de exclusão molecular e cromatografia de troca-iónica. Finalmente, e dado que o principal objectivo deste estudo era avaliar o efeito dos iões metálicos (Ca2+ e Zn2+) na proteína S100A9, foi necessário desmetalar a proteína pura obtida. Para tal, o extracto foi incubado com DTT e EDTA, seguindo-se nova cromatografia de exclusão molecular, de modo a obter a forma pura final da proteína desmetalada. Neste estudo, demonstramos que o Zn2+ tem a capacidade de induzir a agregação da proteína S100A9, quando presente em concentrações superiores à capacidade da sua ligação à proteína S100A9 e quando esta última está presente numa concentração superior a 10μM (concentração critica para agregar). Os agregados formados apresentaram reactividade para com a sonda ThT (usada para detetar estruturas amilóides) e foram visíveis, macroscopicamente, sob a forma de um precipitado branco, conferindo um aspecto turvo, que possibilitou seguimento deste fenómeno por ensaios onde monitorizou a turbidez da solução a 360 nm. A formação deste precipitado ocorreu numa escala de tempo de minutos. Além disso, observou-se que o aumento da quantidade de Zn2+ se correlacionou com um potenciamento do processo de agregação, onde se observou um aumento do sinal em ambos os ensaios (fluorescência e turbidez) e diminuição da fase de inicial (lag phase). Os resultados com as outras sondas conformacionais mostraram estar de acordo com a existência desta agregação. No entanto, apesar de os agregados formados levarem à formação de espécies reactivas à ThT e aos LCOs, os resultados obtidos através de ensaios de seeding, análise por AFM e detecção com os anticorpos conformacionais, OC e A11, sugerem que os agregados formados não são de origem amilóide, mas por outro lado que parecem ser maioritariamente de natureza amorfa. A divergência de resultados pode ser devida ao facto da sonda ThT ter já ter mostrado capacidade de se ligar não só a estruturas amilóides mas também de outra natureza. A possibilidade de estes agregados serem induzidos por interações electrostáticas que afectam a solubilidade da proteína foi excluída, uma vez que as cinéticas de S100A9 em presença de excesso de NaCl não conseguiram reproduzir o mesmo efeito que o Zn2+. Por último, a análise das amostras de S100A9 incubadas com Zn2+ (razão 4:1), por cromatografia de exclusão molecular, foi possível observar a presença de espécies com um tamanho semelhante ao da proteína S100A9 na sua forma tetramérica, o que está concordante com o ensaio de AFM. Estes resultados sugerem que o Zn2+ induz a formação de agregados não amilóides, que precipitam, com um possível papel na quelação do Zn2+. Relativamente ao efeito do Ca2+, sendo este um ligando natural da proteína S100A9, seria expectável que a ligação deste ião metálico não induzisse a agregação amilóide da proteína. De facto, os ensaios de cinética de ligação das várias sondas conformacionais e de imunodetecção pelos anticorpos OC e A11, excluíram a existência de formação de estruturas amilóides. Em concordância, as imagens obtidas por AFM indicam a ocorrência de uma reacção de polimerização do tipo não-amilóide, onde a proteína S100A9 adquire uma aparência semelhante longas “cordas”. Curiosamente, um ensaio controlo usando a forma apo da proteína S100A9, revelou a formação de estruturas semelhantes, mesmo sem a adição de iões metálicos. Estas evidências sugerem uma possível função biológica destes agregados. Curiosamente, quando combinada a ligação de Zn2+ e Ca2+ à S100A9 observou-se um efeito aditivo que se refletiu numa agregação heterogénea, com presença de fibras amilóides e outros agregados intermediários passiveis de serem observados por AFM e de serem detectados pelos anticorpos conformacionais OC e A11. Além disso, todas as sondas mostram reactividade para com a S100A9, mas de uma forma sequenciada, demostrando a complexidade deste fenómeno. Neste caso, à semelhança da agregação induzida apenas pelo Zn2+, a solução tornou-se túrbida com formação de precipitado branco. Por fim, é de salientar que foram efectuados ensaios com EDTA, um agente quelante, para remover os iões metálicos ligados à S100A9 com o objectivo de verificar a dependência dos agregados formados. Assim, foi observada a reversão da reacção de self-assembly pelo desaparecimento da turbidez, diminuição da fluorescência da ThT e diminuição dos oligómeros/estruturas observadas por AFM. Em suma, este estudo contribuiu para revelar possíveis mecanismos, pelos quais a ligação de Zn2+ e/ou Ca2+ à proteína S100A9 influencia a sua reacção de self-assembly. Abrindo, assim, caminho para investigação dos papéis dos vários agregados em condições patológicas, nomeadamente na doença de Alzheimer, e para evidenciar o papel e a relevância da proteína S100A9 no despoletar da doença.