Publicação

The therapeutic potential of small molecules p53-MDM protein-protein interaction inhibitors

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Ao longo dos anos, vários estudos científicos têm comprovado a importância da proteína supressora de tumor p53 na homeostase celular. Esta proteína encontra-se inativada em aproximadamente 50% dos tumores humanos, quer seja por mutação ou por deleção do seu gene. Por outro lado, a inativação da p53 por inibição reversível é frequentemente observada nos tumores que expressam a forma selvagem da proteína. Esta inativação pode resultar da sobre-expressão dos seus reguladores negativos, tais como a proteínas MDM2 e MDMX, conduzindo a patologias oncogénicas caracterizadas principalmente pela expressão da p53 do tipo selvagem. Vários estudos têm demonstrado que a interação da p53 com as MDM’s envolve três aminoácidos hidrofóbicos (Phe19, Trp23 e Leu26) da proteína p53. Além disso, sabe-se que a reativação da p53 é facilitada pela inibição destas interações. Nos últimos anos, várias famílias de compostos têm sido concebidas e desenvolvidas como moduladoras da atividade da p53. No entanto, o objetivo de desenvolver uma terapia anti-tumoural baseada na inibição das interações p53-MDM’s, e consequentemente na reativação da p53, encontra-se ainda no início, com apenas alguns candidatos em ensaios clínicos. Deste modo, torna-se premente a descoberta e desenvolvimento de inibidores mais potentes e seletivos para a interação entre a p53 e os seus reguladores negativos. Nos últimos anos, o nosso grupo de investigação tem vindo a investigar o potencial de várias famílias de spirooxindoles com anéis de cinco membros para o tratamento do cancro. Trabalhos anteriormente desenvolvidos pelo grupo, mostraram que as spiropirazolinas e spiroisoxazolina oxindoles apresentam propriedades anticancerígenas in vitro. O anel spiro encontrado nestes compostos funciona como uma estrutura heterocíclica rígida, a partir da qual podem ser projetados os três grupos lipofílicos que mimetizam a Phe19, Trp23 e Leu26 da p53. Estudos mais detalhados sobre o mecanismo de ação das spiroisoxazolina oxindoles mostraram que estes compostos inibem a interação p53-MDM2. No entanto, estes compostos apenas induziram moderada atividade anti-proliferativa (IC50 cerca de 35 μM) para a linha celular de cancro colo-retal humano HCT-116. Estudos de química computacional indicaram que esta moderada atividade resulta provavelmente da orientação espacial do oxindole nestes compostos não permitir que mimetizasse o resíduo Trp23 da p53, fundamental para ocorrer a ligação à proteína MDM2. Em particular, os estudos de docking molecular mostraram que o oxindole é projetado para a cavidade que seria ocupada pela Phe19 da proteína p53, enquanto os grupos aromáticos ligados ao anel de isoxazolina são projetados para as cavidades Trp23 e Leu26 da p53. A substituição do átomo de oxigénio do anel de isoxazolina por um grupo N-Ar, poderia permitir não só a inclusão de mais um substituinte no anel de 5 membros, como uma reorientação dos substituintes do anel de 5 membros de forma a ocuparem as cavidades da MDM2 a que se ligam os aminoácidos da p53. Por esse motivo, foi desenvolvida uma família de spiropirazolina oxindoles que foi testada nas linhas celulares de cancro da mama humano, MCF-7 e MDA-MB-231. Os compostos mais ativos apresentaram um valor de IC50 cerca de 7 μM. Adicionalmente, estes compostos apresentaram seletividade para a linha celular MDA-MB-231 e não foram tóxicos em células não tumorais Hek-293T. Nesta dissertação, otimizou-se esta família de compostos (spiropirazolina oxindoles) e avaliou-se em mais detalhe os seus efeitos biológicos. As spiropirazolina oxindoles foram obtidas através de uma reação de cicloadição 1,3-dipolar entre 2-indolinonas e nitrilo iminas (formadas in situ a partir de cloretos de hidrazonoílo). Esta nova biblioteca de compostos foi caracterizada e posteriormente avaliada quanto ao seu potencial anti-proliferativo in vitro, utilizando as linhas celulares humanas de cancro colo¬retal HCT-116 e cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231, e glioma de murino GL-261. Para a linha de cancro colo-retal os compostos apresentaram atividades entre os 11-13 µM, e para as linhas de cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231 apresentaram atividades de 7-12 µM e 6-11 µM, respetivamente. No caso da linha celular de glioma de murino, apenas um composto apresentou valores de atividade anti-proliferativa na mesma gama de valores com um IC50 de 19 µM. De salientar, a inclusão de um grupo N-Ar aumentou para mais do dobro a capacidade anti-proliferativa em HCT-116 p53, quando é feita uma comparação direta entre os compostos equivalentes de spiroisoxazolina oxindoles. Com o intuito de avaliar o potencial citotóxico dos compostos em células saudáveis, foi realizado o ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de colon humano normal e em culturas primárias de astroglia de murino. Como resultado, dois compostos (2e e 2m) pertencentes à família spiropirazolina oxindoles não apresentaram citotoxicidade nas células saudáveis, apesar de serem citotóxicos nas linhas celulares de cancro. O mesmo não se verificou para o composto 2q, para o qual foi observada citotoxicidade tanto em células normais como cancerígenas. Os compostos não citotóxicos em células normais foram então avaliados quanto à sua capacidade de indução de apoptose e paragem do ciclo celular na linha celular HCT-116. Os resultados demonstraram que estes compostos induzem tanto a morte por apoptose como a paragem do ciclo celular na fase G0/G1, estando ambos os fenómenos dependentes do tempo de exposição ou concentração de composto utilizada. Com a finalidade de confirmar a capacidade desta família de compostos para induzir a morte celular, foram ainda avaliados os níveis de libertação da enzima citoplasmática lactato desidrogenase (LDH) indicativos do grau de rutura da membrana celular e, por conseguinte, de morte. Os resultados obtidos corroboraram o ensaio de apoptose, confirmando assim a capacidade de indução de morte dependente da concentração. As spiropirazolina oxindoles apresentaram ainda a capacidade de aumentar os níveis de expressão da p53 e induzir a inibição da MDM2, através da diminuição dos seus níveis de expressão proteica. Adicionalmente, a aptidão destes compostos para inibir a interação p53-MDM2 foi observada através do ensaio de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC), e foi ainda verificada uma boa estabilidade em PBS (pH 7.4). Por último, foi observado um efeito sinergético entre um agente quimioterapêutico amplamente utilizado na clínica e um dos compostos em estudos. As spiropirazolina oxindoles foram também avaliadas quanto à capacidade de induzir apoptose e paragem do ciclo celular na linha de glioma de murino GL-261. No entanto, os resultados obtidos não demonstraram qualquer evidência de indução de apoptose ou paragem do ciclo celular nestas células, indicando que estes compostos não têm potencial terapêutico neste tipo de tumores. No âmbito desta tese foi também estudado em mais detalhe o mecanismo de ação de três spirotriazolina oxindoles previamente desenvolvidas no grupo como potenciais agentes anticancerígenos. Resultados obtidos anteriormente, tinham demonstrado que esta família apresentava boa seletividade para as linhas de cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231, sem apresentar citotoxicidade na linha não-tumoral Hek-293T. Observou-se ainda a capacidade destes compostos para inibir a interação p53-MDM2, ativar as caspases-3 e -7 e, consequentemente, induzir apoptose. Por último, uma boa estabilidade em plasma já tinha sido observada para os compostos em estudo. De forma a estudar o eventual mecanismo de ação desta família de compostos como potenciais agentes anticancerígenos, na presente dissertação, testaram-se os compostos mais promissores de spirotriazolina oxindoles em células da linha de cancro colo-retal HCT-116, tendo-se verificado que estes compostos induzem apoptose e clivagem da PARP, assim como a paragem do ciclo celular na fase G0/G1, sendo esta dependente do tempo de exposição ou da concentração de composto utilizada. Adicionalmente, avaliou-se a capacidade destes compostos para ativar a p53 e diminuir os níveis de expressão de MDM2, indicando uma potencial inibição da interação p53-MDM2. A indução de apoptose e paragem do ciclo celular foi também avaliada na linha celular de cancro da mama MDA-MB-231. Contudo, os resultados obtidos não demonstraram qualquer indução de apoptose após 72 horas de exposição das células ao composto. Porém, às 48 horas de exposição das células ao composto foi possível verificar a ativação das caspases-3 e -7 e paragem do ciclo celular na fase G2/M. Por último, os compostos mais promissores de spirotriazolina oxindoles foram testados em fibroblastos de colon humano normal, não se tendo verificado citotoxicidade para as concentrações testadas. Em suma, nesta dissertação demonstrou-se o potencial de cinco compostos (2e, 2m, 7f, 7h e 7z) pertencentes a duas famílias de spirooxindoles, contendo anéis heterocíclicos de 5 membros, como agentes anticancerígenos e inibidores da interação proteína-proteína p53-MDM2.
Autores principais:	Nunes, Rute Cláudia Correia Sacadura
Assunto:	Spirooxindoles Cancer p53 MDM´s Teses de mestrado - 2016
Ano:	2016
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Ao longo dos anos, vários estudos científicos têm comprovado a importância da proteína supressora de tumor p53 na homeostase celular. Esta proteína encontra-se inativada em aproximadamente 50% dos tumores humanos, quer seja por mutação ou por deleção do seu gene. Por outro lado, a inativação da p53 por inibição reversível é frequentemente observada nos tumores que expressam a forma selvagem da proteína. Esta inativação pode resultar da sobre-expressão dos seus reguladores negativos, tais como a proteínas MDM2 e MDMX, conduzindo a patologias oncogénicas caracterizadas principalmente pela expressão da p53 do tipo selvagem. Vários estudos têm demonstrado que a interação da p53 com as MDM’s envolve três aminoácidos hidrofóbicos (Phe19, Trp23 e Leu26) da proteína p53. Além disso, sabe-se que a reativação da p53 é facilitada pela inibição destas interações. Nos últimos anos, várias famílias de compostos têm sido concebidas e desenvolvidas como moduladoras da atividade da p53. No entanto, o objetivo de desenvolver uma terapia anti-tumoural baseada na inibição das interações p53-MDM’s, e consequentemente na reativação da p53, encontra-se ainda no início, com apenas alguns candidatos em ensaios clínicos. Deste modo, torna-se premente a descoberta e desenvolvimento de inibidores mais potentes e seletivos para a interação entre a p53 e os seus reguladores negativos. Nos últimos anos, o nosso grupo de investigação tem vindo a investigar o potencial de várias famílias de spirooxindoles com anéis de cinco membros para o tratamento do cancro. Trabalhos anteriormente desenvolvidos pelo grupo, mostraram que as spiropirazolinas e spiroisoxazolina oxindoles apresentam propriedades anticancerígenas in vitro. O anel spiro encontrado nestes compostos funciona como uma estrutura heterocíclica rígida, a partir da qual podem ser projetados os três grupos lipofílicos que mimetizam a Phe19, Trp23 e Leu26 da p53. Estudos mais detalhados sobre o mecanismo de ação das spiroisoxazolina oxindoles mostraram que estes compostos inibem a interação p53-MDM2. No entanto, estes compostos apenas induziram moderada atividade anti-proliferativa (IC50 cerca de 35 μM) para a linha celular de cancro colo-retal humano HCT-116. Estudos de química computacional indicaram que esta moderada atividade resulta provavelmente da orientação espacial do oxindole nestes compostos não permitir que mimetizasse o resíduo Trp23 da p53, fundamental para ocorrer a ligação à proteína MDM2. Em particular, os estudos de docking molecular mostraram que o oxindole é projetado para a cavidade que seria ocupada pela Phe19 da proteína p53, enquanto os grupos aromáticos ligados ao anel de isoxazolina são projetados para as cavidades Trp23 e Leu26 da p53. A substituição do átomo de oxigénio do anel de isoxazolina por um grupo N-Ar, poderia permitir não só a inclusão de mais um substituinte no anel de 5 membros, como uma reorientação dos substituintes do anel de 5 membros de forma a ocuparem as cavidades da MDM2 a que se ligam os aminoácidos da p53. Por esse motivo, foi desenvolvida uma família de spiropirazolina oxindoles que foi testada nas linhas celulares de cancro da mama humano, MCF-7 e MDA-MB-231. Os compostos mais ativos apresentaram um valor de IC50 cerca de 7 μM. Adicionalmente, estes compostos apresentaram seletividade para a linha celular MDA-MB-231 e não foram tóxicos em células não tumorais Hek-293T. Nesta dissertação, otimizou-se esta família de compostos (spiropirazolina oxindoles) e avaliou-se em mais detalhe os seus efeitos biológicos. As spiropirazolina oxindoles foram obtidas através de uma reação de cicloadição 1,3-dipolar entre 2-indolinonas e nitrilo iminas (formadas in situ a partir de cloretos de hidrazonoílo). Esta nova biblioteca de compostos foi caracterizada e posteriormente avaliada quanto ao seu potencial anti-proliferativo in vitro, utilizando as linhas celulares humanas de cancro colo¬retal HCT-116 e cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231, e glioma de murino GL-261. Para a linha de cancro colo-retal os compostos apresentaram atividades entre os 11-13 µM, e para as linhas de cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231 apresentaram atividades de 7-12 µM e 6-11 µM, respetivamente. No caso da linha celular de glioma de murino, apenas um composto apresentou valores de atividade anti-proliferativa na mesma gama de valores com um IC50 de 19 µM. De salientar, a inclusão de um grupo N-Ar aumentou para mais do dobro a capacidade anti-proliferativa em HCT-116 p53, quando é feita uma comparação direta entre os compostos equivalentes de spiroisoxazolina oxindoles. Com o intuito de avaliar o potencial citotóxico dos compostos em células saudáveis, foi realizado o ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de colon humano normal e em culturas primárias de astroglia de murino. Como resultado, dois compostos (2e e 2m) pertencentes à família spiropirazolina oxindoles não apresentaram citotoxicidade nas células saudáveis, apesar de serem citotóxicos nas linhas celulares de cancro. O mesmo não se verificou para o composto 2q, para o qual foi observada citotoxicidade tanto em células normais como cancerígenas. Os compostos não citotóxicos em células normais foram então avaliados quanto à sua capacidade de indução de apoptose e paragem do ciclo celular na linha celular HCT-116. Os resultados demonstraram que estes compostos induzem tanto a morte por apoptose como a paragem do ciclo celular na fase G0/G1, estando ambos os fenómenos dependentes do tempo de exposição ou concentração de composto utilizada. Com a finalidade de confirmar a capacidade desta família de compostos para induzir a morte celular, foram ainda avaliados os níveis de libertação da enzima citoplasmática lactato desidrogenase (LDH) indicativos do grau de rutura da membrana celular e, por conseguinte, de morte. Os resultados obtidos corroboraram o ensaio de apoptose, confirmando assim a capacidade de indução de morte dependente da concentração. As spiropirazolina oxindoles apresentaram ainda a capacidade de aumentar os níveis de expressão da p53 e induzir a inibição da MDM2, através da diminuição dos seus níveis de expressão proteica. Adicionalmente, a aptidão destes compostos para inibir a interação p53-MDM2 foi observada através do ensaio de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC), e foi ainda verificada uma boa estabilidade em PBS (pH 7.4). Por último, foi observado um efeito sinergético entre um agente quimioterapêutico amplamente utilizado na clínica e um dos compostos em estudos. As spiropirazolina oxindoles foram também avaliadas quanto à capacidade de induzir apoptose e paragem do ciclo celular na linha de glioma de murino GL-261. No entanto, os resultados obtidos não demonstraram qualquer evidência de indução de apoptose ou paragem do ciclo celular nestas células, indicando que estes compostos não têm potencial terapêutico neste tipo de tumores. No âmbito desta tese foi também estudado em mais detalhe o mecanismo de ação de três spirotriazolina oxindoles previamente desenvolvidas no grupo como potenciais agentes anticancerígenos. Resultados obtidos anteriormente, tinham demonstrado que esta família apresentava boa seletividade para as linhas de cancro da mama MCF-7 e MDA-MB-231, sem apresentar citotoxicidade na linha não-tumoral Hek-293T. Observou-se ainda a capacidade destes compostos para inibir a interação p53-MDM2, ativar as caspases-3 e -7 e, consequentemente, induzir apoptose. Por último, uma boa estabilidade em plasma já tinha sido observada para os compostos em estudo. De forma a estudar o eventual mecanismo de ação desta família de compostos como potenciais agentes anticancerígenos, na presente dissertação, testaram-se os compostos mais promissores de spirotriazolina oxindoles em células da linha de cancro colo-retal HCT-116, tendo-se verificado que estes compostos induzem apoptose e clivagem da PARP, assim como a paragem do ciclo celular na fase G0/G1, sendo esta dependente do tempo de exposição ou da concentração de composto utilizada. Adicionalmente, avaliou-se a capacidade destes compostos para ativar a p53 e diminuir os níveis de expressão de MDM2, indicando uma potencial inibição da interação p53-MDM2. A indução de apoptose e paragem do ciclo celular foi também avaliada na linha celular de cancro da mama MDA-MB-231. Contudo, os resultados obtidos não demonstraram qualquer indução de apoptose após 72 horas de exposição das células ao composto. Porém, às 48 horas de exposição das células ao composto foi possível verificar a ativação das caspases-3 e -7 e paragem do ciclo celular na fase G2/M. Por último, os compostos mais promissores de spirotriazolina oxindoles foram testados em fibroblastos de colon humano normal, não se tendo verificado citotoxicidade para as concentrações testadas. Em suma, nesta dissertação demonstrou-se o potencial de cinco compostos (2e, 2m, 7f, 7h e 7z) pertencentes a duas famílias de spirooxindoles, contendo anéis heterocíclicos de 5 membros, como agentes anticancerígenos e inibidores da interação proteína-proteína p53-MDM2.