Publicação

Association of DNA modifications with somatic mutations in cancer

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O cancro desenvolve-se a partir da acumulação de mutações e alterações epigenéticas que modificam os padrões celulares de expressão génica, conferindo às células uma vantagem seletiva de crescimento no ambiente em que se inserem. A identificação das condições e mecanismos que originaram essas mutações e alterações epigenéticas é extremamente importante para perceber a carcinogénese e o conhecimento fundamental sobre os processos que controlam e/ou perturbam as informações contidas na cromatina permitiria desenvolver estratégias para prevenir, mitigar e tratar o cancro. Nos últimos anos, o crescimento de novas técnicas de sequenciação permitiu o identificar características comuns entre os vários tipos de cancro. Por exemplo, Hodgkinson et al. demostraram, utilizando dados de sequenciação, que a densidade de mutações somáticas estava relacionada entre três tipos de cancro analisados e também com mutações em linhas germinais. Este estudo destacou que certas propriedades do genoma humano podem moldar a distribuição de mutações de forma não aleatória e incentivou Schuster-Böckler et al. a compararem diversos fatores genéticos e epigenéticos, utilizando amostras de diferentes tipos de cancro, com a densidade de mutações. Observou-se nessa análise que regiões com alta frequência mutações estão relacionadas com um tipo de modificação de histonas associada a heterocromatina, H3K9me3 (histona H3 lisina 9 trimetilada), tendo esta modificação sido responsável por mais de 40% da variação da taxa de mutações, indicando que a estrutura da cromatina tem uma forte influência na densidade de mutações em células somáticas humanas. Outro estudo, por Polak et al., investigou a distribuição de mutações de vários tipos de cancro e comparou-a com a específica distribuição de modificações epigenéticas de diferentes tipos de células. Os resultados revelaram que a acessibilidade e a modificação da cromatina, juntamente com o tempo de replicação, explicam até 86% da variação das taxas de mutação, com regiões de alta densidade de mutações a associar com uma estrutura de cromatina condensada. Surpreendentemente, as características epigénicas derivadas do tipo de célula de origem dos cancros foram melhores determinantes da distribuição de mutações que as características epigenéticas das linhas celulares dos cancros testados. Estes estudos destacaram a relevância da influência da estrutura da cromatina, e das modificações epigenéticas associadas, na densidade de mutações. No entanto, estudos recentes evidenciam que modificações epigenéticas podem ter um papel mais direto na modelação da distribuição de mutações em cancro, tendo sido observado uma associação entre um tipo de modificação epigenética e dois mecanismos que podem afetar o genoma de forma oposta: formação de R-loops e reparação do DNA. Essa modificação epigenética é a 5-hidroximetilcitosina (5hmC), uma modificação no DNA predominantemente estável, presente em altos níveis no cérebro e em células estaminais embrionárias, com funções na regulação de diversos processos celulares e de desenvolvimento, incluindo na pluripotência de células estaminais embrionárias, no desenvolvimento de neurônios e na tumorogénese em mamíferos. Para além dessas funções, observou-se que esta modificação de DNA pode contribuir para a reparação do DNA e manutenção da integridade do genoma. Essa contribuição foi primeiro observada pelo grupo Jiali Li, quando em células Purkinje de murganho houve uma produção de 5hmC mediada por TET1 e dependente da ATM em resposta a danos induzidos no DNA. Posteriormente, o mesmo grupo demonstrou que quando existe dano no DNA, induzido por luz ultravioleta ou por um inibidor da topoisomerase I, a cinase ATR fosforila TET3 e promove um aumento moderado nos níveis globais de 5hmC. Apesar destes estudos não revelarem se o aumento de 5hmC se localiza especificamente em regiões do DNA onde o dano ocorreu, Kafer et al. demostraram a colocalização de 5hmC com vários fatores de reparação (53BP1, Rad51, γ-H2AX) em células humanas HeLa, HCC827 e A594, sendo a TET2 necessária para a produção de 5hmC após a indução de dano, evidenciando que o enriquecimento desta modificação do DNA pode ocorrer especificamente nas regiões onde o DNA foi danificado. Por outro lado, recentemente no laboratório onde esta tese foi conduzida, dados preliminares indicaram uma conexão entre a presença de 5hmC e a formação de R-loops—estruturas híbridas de DNA e RNA que se formam durante a transcrição, resultantes da invasão do RNA nascente a extensões de DNA com cadeias separadas a montante da RNA polimerase e da sua subsequente ligação com a cadeia de DNA complementar. R-loops têm funções importantes na iniciação e terminação da transcrição, mas também são ameaças à integridade do genoma. Uma das formas que pode criar instabilidade no genoma é quando a sua formação inadequada causa a colisão dos processos transcrição e de replicação, e, consequentemente, gera quebras no DNA que, se não forem reparadas adequadamente, podem produzir mutações. Estes resultados criaram um aparente conflito entre a observada função de 5hmC na reparação do DNA e a sua associação à formação de R-loops podendo ser uma fonte de instabilidade genómica. Este conflito incentivou uma análise bioinformática para avaliar a densidade de mutações somáticas em regiões enriquecidas por 5hmC, com o objetivo de esclarecer o papel promissor dessa modificação na instabilidade genómica e/ou na reparação do DNA e, em última análise, no desenvolvimento ou prevenção de cancro. Adicionalmente, o mesmo tipo de análise foi realizado para regiões enriquecidas por outra modificação da citosina, 5-metilcitosina (5mC), para distinguir como diferentes tipos de modificações de DNA afetam a densidade de mutações. A análise bioinformática foi executada com dados de sequenciação, contendo informação sobre a distribuição de 5hmC e sobre a localização e tipo de mutações nos genomas de pacientes com leucemia mielóide aguda (AML) e de pacientes com melanoma cutâneo (SKCM), recolhidos de base de dados públicas de estudos previamente realizados. Utilizando esses dados, foi conduzida uma análise comparativa entre o número de mutações em exões localizados em regiões enriquecidas por 5hmC e exões localizados em regiões sem modificações de citosinas (sem 5mC e 5hmC). A partir dos resultados obtidos, verificou-se que pode haver uma relação entre a presença de 5hmC e mecanismos de reparação do DNA apenas para mutações C>T, uma vez que foi observada uma redução significativa no número desse tipo de mutações em exões localizados em regiões enriquecidas por 5hmC. Mas, a análise revelou também que a presença 5hmC pode estar associada a instabilidade genómica, já que em pacientes com AML foi observado um aumento de deleções em exões localizados em regiões enriquecidas por 5hmC. No entanto, também se observou um aumento de deleções em exões localizados em regiões enriquecidas por 5mC, indicando que ambos os tipos de modificação possam ter um papel na instabilidade genómica. De facto, houve uma maior densidade de praticamente todos os tipos de mutações em exões localizados em regiões enriquecidas por 5mC, fortalecendo a anteriormente observada correlação entre mutações e cromatina repressiva, uma vez que 5mC é conhecida por ter um papel na regulação da heterocromatina. Em conclusão, os resultados não indicaram claramente uma relação entre 5hmC e reparação do DNA ou instabilidade genómica. Serão necessários mais estudos para compreender qual é a influência de 5hmC no genoma do cancro e qual é papel das modificações do DNA na formação de mutações somáticas. Este tipo de análise deve ser complementado com mais cancros, com um maior número de pacientes, com diversas modificações epigenéticas, com dados de acessibilidade da cromatina, e com perfis de transcrição, para que sejam considerados todos os processos que possam estar envolvidos na formação de mutações e que sejam determinados os mecanismos que afetam a densidade de mutações em genomas de cancro. Ainda assim, tanto este estudo como outros que relacionam modificações epigenéticas com mutações realçam a necessidade de investigar os processos fundamentais e dinâmicos que moldam e interagem com o genoma para que no futuro tenhamos um conhecimento detalhado sobre os mecanismos que levam à carcinogénese.
Autores principais:	Sousa, João Pedro Agostinho de
Assunto:	5-hidroximetilcitosina Mutações somáticas Reparação do DNA R-loops Cancro Teses de mestrado - 2018
Ano:	2018
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O cancro desenvolve-se a partir da acumulação de mutações e alterações epigenéticas que modificam os padrões celulares de expressão génica, conferindo às células uma vantagem seletiva de crescimento no ambiente em que se inserem. A identificação das condições e mecanismos que originaram essas mutações e alterações epigenéticas é extremamente importante para perceber a carcinogénese e o conhecimento fundamental sobre os processos que controlam e/ou perturbam as informações contidas na cromatina permitiria desenvolver estratégias para prevenir, mitigar e tratar o cancro. Nos últimos anos, o crescimento de novas técnicas de sequenciação permitiu o identificar características comuns entre os vários tipos de cancro. Por exemplo, Hodgkinson et al. demostraram, utilizando dados de sequenciação, que a densidade de mutações somáticas estava relacionada entre três tipos de cancro analisados e também com mutações em linhas germinais. Este estudo destacou que certas propriedades do genoma humano podem moldar a distribuição de mutações de forma não aleatória e incentivou Schuster-Böckler et al. a compararem diversos fatores genéticos e epigenéticos, utilizando amostras de diferentes tipos de cancro, com a densidade de mutações. Observou-se nessa análise que regiões com alta frequência mutações estão relacionadas com um tipo de modificação de histonas associada a heterocromatina, H3K9me3 (histona H3 lisina 9 trimetilada), tendo esta modificação sido responsável por mais de 40% da variação da taxa de mutações, indicando que a estrutura da cromatina tem uma forte influência na densidade de mutações em células somáticas humanas. Outro estudo, por Polak et al., investigou a distribuição de mutações de vários tipos de cancro e comparou-a com a específica distribuição de modificações epigenéticas de diferentes tipos de células. Os resultados revelaram que a acessibilidade e a modificação da cromatina, juntamente com o tempo de replicação, explicam até 86% da variação das taxas de mutação, com regiões de alta densidade de mutações a associar com uma estrutura de cromatina condensada. Surpreendentemente, as características epigénicas derivadas do tipo de célula de origem dos cancros foram melhores determinantes da distribuição de mutações que as características epigenéticas das linhas celulares dos cancros testados. Estes estudos destacaram a relevância da influência da estrutura da cromatina, e das modificações epigenéticas associadas, na densidade de mutações. No entanto, estudos recentes evidenciam que modificações epigenéticas podem ter um papel mais direto na modelação da distribuição de mutações em cancro, tendo sido observado uma associação entre um tipo de modificação epigenética e dois mecanismos que podem afetar o genoma de forma oposta: formação de R-loops e reparação do DNA. Essa modificação epigenética é a 5-hidroximetilcitosina (5hmC), uma modificação no DNA predominantemente estável, presente em altos níveis no cérebro e em células estaminais embrionárias, com funções na regulação de diversos processos celulares e de desenvolvimento, incluindo na pluripotência de células estaminais embrionárias, no desenvolvimento de neurônios e na tumorogénese em mamíferos. Para além dessas funções, observou-se que esta modificação de DNA pode contribuir para a reparação do DNA e manutenção da integridade do genoma. Essa contribuição foi primeiro observada pelo grupo Jiali Li, quando em células Purkinje de murganho houve uma produção de 5hmC mediada por TET1 e dependente da ATM em resposta a danos induzidos no DNA. Posteriormente, o mesmo grupo demonstrou que quando existe dano no DNA, induzido por luz ultravioleta ou por um inibidor da topoisomerase I, a cinase ATR fosforila TET3 e promove um aumento moderado nos níveis globais de 5hmC. Apesar destes estudos não revelarem se o aumento de 5hmC se localiza especificamente em regiões do DNA onde o dano ocorreu, Kafer et al. demostraram a colocalização de 5hmC com vários fatores de reparação (53BP1, Rad51, γ-H2AX) em células humanas HeLa, HCC827 e A594, sendo a TET2 necessária para a produção de 5hmC após a indução de dano, evidenciando que o enriquecimento desta modificação do DNA pode ocorrer especificamente nas regiões onde o DNA foi danificado. Por outro lado, recentemente no laboratório onde esta tese foi conduzida, dados preliminares indicaram uma conexão entre a presença de 5hmC e a formação de R-loops—estruturas híbridas de DNA e RNA que se formam durante a transcrição, resultantes da invasão do RNA nascente a extensões de DNA com cadeias separadas a montante da RNA polimerase e da sua subsequente ligação com a cadeia de DNA complementar. R-loops têm funções importantes na iniciação e terminação da transcrição, mas também são ameaças à integridade do genoma. Uma das formas que pode criar instabilidade no genoma é quando a sua formação inadequada causa a colisão dos processos transcrição e de replicação, e, consequentemente, gera quebras no DNA que, se não forem reparadas adequadamente, podem produzir mutações. Estes resultados criaram um aparente conflito entre a observada função de 5hmC na reparação do DNA e a sua associação à formação de R-loops podendo ser uma fonte de instabilidade genómica. Este conflito incentivou uma análise bioinformática para avaliar a densidade de mutações somáticas em regiões enriquecidas por 5hmC, com o objetivo de esclarecer o papel promissor dessa modificação na instabilidade genómica e/ou na reparação do DNA e, em última análise, no desenvolvimento ou prevenção de cancro. Adicionalmente, o mesmo tipo de análise foi realizado para regiões enriquecidas por outra modificação da citosina, 5-metilcitosina (5mC), para distinguir como diferentes tipos de modificações de DNA afetam a densidade de mutações. A análise bioinformática foi executada com dados de sequenciação, contendo informação sobre a distribuição de 5hmC e sobre a localização e tipo de mutações nos genomas de pacientes com leucemia mielóide aguda (AML) e de pacientes com melanoma cutâneo (SKCM), recolhidos de base de dados públicas de estudos previamente realizados. Utilizando esses dados, foi conduzida uma análise comparativa entre o número de mutações em exões localizados em regiões enriquecidas por 5hmC e exões localizados em regiões sem modificações de citosinas (sem 5mC e 5hmC). A partir dos resultados obtidos, verificou-se que pode haver uma relação entre a presença de 5hmC e mecanismos de reparação do DNA apenas para mutações C>T, uma vez que foi observada uma redução significativa no número desse tipo de mutações em exões localizados em regiões enriquecidas por 5hmC. Mas, a análise revelou também que a presença 5hmC pode estar associada a instabilidade genómica, já que em pacientes com AML foi observado um aumento de deleções em exões localizados em regiões enriquecidas por 5hmC. No entanto, também se observou um aumento de deleções em exões localizados em regiões enriquecidas por 5mC, indicando que ambos os tipos de modificação possam ter um papel na instabilidade genómica. De facto, houve uma maior densidade de praticamente todos os tipos de mutações em exões localizados em regiões enriquecidas por 5mC, fortalecendo a anteriormente observada correlação entre mutações e cromatina repressiva, uma vez que 5mC é conhecida por ter um papel na regulação da heterocromatina. Em conclusão, os resultados não indicaram claramente uma relação entre 5hmC e reparação do DNA ou instabilidade genómica. Serão necessários mais estudos para compreender qual é a influência de 5hmC no genoma do cancro e qual é papel das modificações do DNA na formação de mutações somáticas. Este tipo de análise deve ser complementado com mais cancros, com um maior número de pacientes, com diversas modificações epigenéticas, com dados de acessibilidade da cromatina, e com perfis de transcrição, para que sejam considerados todos os processos que possam estar envolvidos na formação de mutações e que sejam determinados os mecanismos que afetam a densidade de mutações em genomas de cancro. Ainda assim, tanto este estudo como outros que relacionam modificações epigenéticas com mutações realçam a necessidade de investigar os processos fundamentais e dinâmicos que moldam e interagem com o genoma para que no futuro tenhamos um conhecimento detalhado sobre os mecanismos que levam à carcinogénese.