Publicação

Development of a PCR system for detection and differentiation of Bulkholderia mallei and B. pseudomallei in clinical and environmental matrices

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Mormo e melioidose são patologias causadas pelas bactérias Gram-negativas Burkholderia mallei e B. pseudomallei, respectivamente. Sendo os equídeos o principal alvo hospedeiro de mormo, cavalos, mulas e burros para exportação necessitam de procedimentos standard europeus de despistagem do agente através de ensaios de fixação do complemento pela detecção de anticorpos específicos. Erradicado de Portugal em 1952 e da Europa Ocidental, o mormo é ainda reportado em alguns locais da Ásia, África, Médio Oriente e América do Sul. Nunca declarada em território português, a melioidose trata-se duma doença endémica em países como Tailândia e norte da Austrália, com expansão em países do continente asiático como as Filipinas, India, Indonésia, Laos, Singapura, Camboja e Vietname, alertando-se também para sua existência em zonas de África e América do Sul. O potencial zoonótico de B. mallei é descrito na literatura, estando identificados como principais grupos de risco investigadores científicos, cujo alvo de estudo implica a manipulação e multiplicação do microorganismo, profissionais de medicina veterinária e funcionários de matadouros. Afectando os animais, o homem e ambiente, a capacidade zoonótica de B.pseudomallei não se encontra estabelecida. Contudo, estão declarados inúmeros factores de risco que contribuem para a transmissão da doença no hospedeiro humano, nomeadamente: diabetes, alcoolismo, doenças crónicas renais, hepáticas e pulmonares e terapias imunossupressoras. As manifestações clínicas de ambas as patologias culminam, geralmente, em vastas complicações a nível pulmonar, podendo levar à morte. As vias de transmissão das duas doenças são principalmente cutânea, através de lesões expostas, inalação e, ocasionalmente, ingestão. Não existem vacinas ou tratamentos 100% eficientes contra ambas as doenças. Contudo, algumas terapias com base em combinações de diversos antibióticos têm sido estabelecidas mas a sua eficácia depende do progresso de cada patologia e, portanto, qualquer caso de mormo e/ou melioidose deve ser tratado com o máximo de brevidade possível. Devido à sua rápida disseminação, capacidade de infecção por inoculação e formação de aerossóis, alto factor de contágio e largo espectro de resistência antimicrobiana, B. mallei e B. pseudomallei foram classificados como agentes de classe B pelo Centre of Disease Control (CDC) e de risco 3 pelo Parlamento Europeu, segundo a Directiva 2000/54/CE. Numa reunião organizada em conjunto pela Organização Mundial da Saúde (WHO) e a Organização Mundial da Saúde Animal (OIE), especialistas alertaram para o risco eminente em países cujos mecanismos de preparação e prevenção para determinados agentes se encontram inactivos, tornando-os mais susceptíveis à libertação deliberada do agente. Tendo em conta as declarações acima descritas, protocolos foram estabelecidos para a detecção e diferenciação de B. mallei e B. pseudomallei, utilizando a metodologia biomolecular através da técnica quantitativa em tempo real de reacção de polimerização em cadeia (qPCR) em matrizes clínicas e ambientais. Deste modo, e uma vez que não existem amostras clínicas e ambientais de mormo e/ou melioidose em Portugal, três matrizes foram seleccionadas para serem inoculadas com diluições decimais seriadas de B. mallei NCTC 10245 e B. pseudomallei NCTC 10276, de modo a obterem-se amostras experimentalmente infectadas ou spiked samples. A escolha das matrizes teve em consideração as amostras comumente recolhidas quando há suspeita de alguma destas infecções: zaragatoas, pois os exsudados ou feridas purulentas são normalmente colhidos com estas ferramentas; macerados pulmonares, visto que ambas as doenças proliferam a nível pulmonar e, no caso específico de melioidose, solos, uma vez que este é o reservatório natural de B. pseudomallei. À excepção dos macerados pulmonares, a identificação de ambos microorganismos nas spiked samples foi avaliada em dois tempos diferentes: imediatamente após a infecção, e 48 horas após incubação das matrizes a 37 ºC, comparando a sensibilidade de detecção do método de cultura com a metodologia de qPCR desenvolvida. O isolamento dos agentes através de cultura bacteriana foi realizado utilizando o meio de cultura Agar Ashdown’s, específico de B. pseudomallei, e o meio de Agar Columbia com 5% de sangue carneiro para B. mallei. Enquanto B. pseudomallei produz colónias rosas rugosas morfologicamente distinguíveis, as colónias de B. mallei não detêm características particulares que permitam a sua diferenciação doutras bactérias. O duplex qPCR desenvolvido consiste num sistema capaz de identificar e diferenciar os dois microorganismos num só tubo de reacção. Dois alvos foram escolhidos para a detecção e diferenciação de B. mallei e B. pseudomallei: o gene psu que codifica para uma putativa acetiltransferase, pertencente ao cluster de genes do sistema tipo III de secreção de B. pseudomallei e um gene que codifica uma transposase ISBma2, uma sequência de inserção presente em cerca de 48 cópias e 6 cópias em B. mallei e B. pseudomallei, respectivamente. Deste modo, a amplificação e detecção de sinal por parte das sondas de hidrolisação dos dois genes alvo corresponde à identificação positiva de B. pseudomallei enquanto, a amplificação e detecção apenas do gene que codifica a transposase ISBma2 diz respeito a uma amostra positiva para B.mallei. Junto desta plataforma de diagnóstico, foi também construído um controlo interno de amplificação (IAC – Internal Amplification Control), pNZYmyx, clonando o fragmento de 125 pares de base do gene diplóide m000.5 L/R da estirpe Laussane do mixoma vírus no vector pNZY28. A finalidade deste controlo consiste em aferir se a reacção de PCR detém qualquer factor que resulte na inibição da reacção, afectando a amplificação dos genes alvo. A adaptação deste sistema de qPCR necessitou de optimização dos oligonucleotídeos necessários à reacção (iniciadores ou primers e sondas) bem como o ajuste da sua temperatura de hibridação (annealing) utilizando as estirpes de referência B. mallei NCTC 12938T e B. pseudomallei NCTC 12939T. Esta optimização de reacção foi executada com os dois alvos em separado (singleplex) e em conjunto (duplex), seguida de testes de especificidade, sensibilidade, repetibilidade e reprodutibilidade. Em singleplex, a concentração final óptima para cada alvo provou ser 400 nM enquanto que a concentração óptima das sondas de hidrolisação foram 100nM e 300 nM para ISBma2 e psu, respectivamente. As concentrações finais óptimas em duplex de primers e sonda para ambos os alvos foram, respectivamente, 400 nM e 200nM e a temperatura de annealing que demonstrou o Cq (Quantification Cycle) mais baixo foi de 58.1 ºC. A especificidade do sistema foi provada testando o qPCR com 17 microorganismos, incluindo Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeroginosa e a espécie geneticamente próxima, Burkholderia thailandensis, na qual o sinal de fluorescência foi somente detectado em B. mallei e B. pseudomallei. O sistema duplex qPCR provou ser capaz de detectar 29 fg e 455 fg de DNA de B. mallei e B. pseudomallei, respectivamente. O coeficiente de variação calculado para avaliar a repetibilidade e reprodutibilidade obteve valores máximos de 1.337% e de 2.288 %, respectivamente comprovando este sistema ser altamente repetível e reproduzível. A técnica de qPCR estabelecida foi capaz de identificar e distinguir os dois microorganismos em todas as matrizes inoculadas. No que diz respeito aos macerados pulmonares, o qPCR foi capaz de identificar correctamente os dois microorganismos até à diluição menos concentrada (10-6) detendo valores de Cq entre 15.93 (10-1) e 25.95 (10-6) em B. mallei e entre 23.44 (10-1 – alvo psu) e 38.18 (10-6 - alvo psu) para B. pseudomallei. Foi também possível identificar ambos agentes até à diluição menos concentradas para zaragatoas sem o passo de incubação, variando os valores de Cq entre 20.33 (10-1) e 39.25 (10-6) for B. mallei e entre 28.98 (10-1 - alvo psu) e 38.37 (10-6 - alvo psu) para B. pseudomallei. A adição prévia do passo de incubação para as zaragotoas demonstrou uma variação ligeira indicando com valores de Cq inferiores comparativamente às zaragatoas não incubadas. A detecção de B. pseudomallei em solos sem incubação prévia foi igualmente possível até à diluição menos concentrada. Porém, a análise de colónias isoladas provou ser altamente sensível, detectando todas as amostras com valores de Cq inferiores a 30. No entanto, o isolamento por cultura bacteriana (gold standard) provou ser um método de diagnóstico menos sensível comparando com o sistema de qPCR. A sensibilidade obtida por meio de cultura e qPCR para B. pseudomallei foi, respectivamente, 80% e 97% indicando uma baixa percentagem de falsos negativos para as duas metodologias, contudo, o método de qPCR é mais sensível mostrando ser capaz de identificar amostras consideradas negativas pelo método de cultura. Comparativamente, o método de qPCR para B.mallei mostrou ser 100% sensível ao identificar o microorganismo em todas as amostras enquanto que a sensibilidade do método de cultura para a isolação deste agente é significativamente menor, 17%, possivelmente devido à falta de um meio de cultura específico para o isolamento deste microorganismo. Desta forma, a identificação de B. mallei e B. pseudomallei por qPCR consiste num teste de diagnóstico sensível, específico, repetível e reprodutível capaz de identificar e diferenciar os dois agentes em amostras previamente inoculadas.
Autores principais:	Brás, Catarina Barreto
Assunto:	Burkholderia mallei Burkholderia pseudomallei Duplex qPCR Spiked samples Bioterrorismo Teses de mestrado - 2015
Ano:	2015
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Mormo e melioidose são patologias causadas pelas bactérias Gram-negativas Burkholderia mallei e B. pseudomallei, respectivamente. Sendo os equídeos o principal alvo hospedeiro de mormo, cavalos, mulas e burros para exportação necessitam de procedimentos standard europeus de despistagem do agente através de ensaios de fixação do complemento pela detecção de anticorpos específicos. Erradicado de Portugal em 1952 e da Europa Ocidental, o mormo é ainda reportado em alguns locais da Ásia, África, Médio Oriente e América do Sul. Nunca declarada em território português, a melioidose trata-se duma doença endémica em países como Tailândia e norte da Austrália, com expansão em países do continente asiático como as Filipinas, India, Indonésia, Laos, Singapura, Camboja e Vietname, alertando-se também para sua existência em zonas de África e América do Sul. O potencial zoonótico de B. mallei é descrito na literatura, estando identificados como principais grupos de risco investigadores científicos, cujo alvo de estudo implica a manipulação e multiplicação do microorganismo, profissionais de medicina veterinária e funcionários de matadouros. Afectando os animais, o homem e ambiente, a capacidade zoonótica de B.pseudomallei não se encontra estabelecida. Contudo, estão declarados inúmeros factores de risco que contribuem para a transmissão da doença no hospedeiro humano, nomeadamente: diabetes, alcoolismo, doenças crónicas renais, hepáticas e pulmonares e terapias imunossupressoras. As manifestações clínicas de ambas as patologias culminam, geralmente, em vastas complicações a nível pulmonar, podendo levar à morte. As vias de transmissão das duas doenças são principalmente cutânea, através de lesões expostas, inalação e, ocasionalmente, ingestão. Não existem vacinas ou tratamentos 100% eficientes contra ambas as doenças. Contudo, algumas terapias com base em combinações de diversos antibióticos têm sido estabelecidas mas a sua eficácia depende do progresso de cada patologia e, portanto, qualquer caso de mormo e/ou melioidose deve ser tratado com o máximo de brevidade possível. Devido à sua rápida disseminação, capacidade de infecção por inoculação e formação de aerossóis, alto factor de contágio e largo espectro de resistência antimicrobiana, B. mallei e B. pseudomallei foram classificados como agentes de classe B pelo Centre of Disease Control (CDC) e de risco 3 pelo Parlamento Europeu, segundo a Directiva 2000/54/CE. Numa reunião organizada em conjunto pela Organização Mundial da Saúde (WHO) e a Organização Mundial da Saúde Animal (OIE), especialistas alertaram para o risco eminente em países cujos mecanismos de preparação e prevenção para determinados agentes se encontram inactivos, tornando-os mais susceptíveis à libertação deliberada do agente. Tendo em conta as declarações acima descritas, protocolos foram estabelecidos para a detecção e diferenciação de B. mallei e B. pseudomallei, utilizando a metodologia biomolecular através da técnica quantitativa em tempo real de reacção de polimerização em cadeia (qPCR) em matrizes clínicas e ambientais. Deste modo, e uma vez que não existem amostras clínicas e ambientais de mormo e/ou melioidose em Portugal, três matrizes foram seleccionadas para serem inoculadas com diluições decimais seriadas de B. mallei NCTC 10245 e B. pseudomallei NCTC 10276, de modo a obterem-se amostras experimentalmente infectadas ou spiked samples. A escolha das matrizes teve em consideração as amostras comumente recolhidas quando há suspeita de alguma destas infecções: zaragatoas, pois os exsudados ou feridas purulentas são normalmente colhidos com estas ferramentas; macerados pulmonares, visto que ambas as doenças proliferam a nível pulmonar e, no caso específico de melioidose, solos, uma vez que este é o reservatório natural de B. pseudomallei. À excepção dos macerados pulmonares, a identificação de ambos microorganismos nas spiked samples foi avaliada em dois tempos diferentes: imediatamente após a infecção, e 48 horas após incubação das matrizes a 37 ºC, comparando a sensibilidade de detecção do método de cultura com a metodologia de qPCR desenvolvida. O isolamento dos agentes através de cultura bacteriana foi realizado utilizando o meio de cultura Agar Ashdown’s, específico de B. pseudomallei, e o meio de Agar Columbia com 5% de sangue carneiro para B. mallei. Enquanto B. pseudomallei produz colónias rosas rugosas morfologicamente distinguíveis, as colónias de B. mallei não detêm características particulares que permitam a sua diferenciação doutras bactérias. O duplex qPCR desenvolvido consiste num sistema capaz de identificar e diferenciar os dois microorganismos num só tubo de reacção. Dois alvos foram escolhidos para a detecção e diferenciação de B. mallei e B. pseudomallei: o gene psu que codifica para uma putativa acetiltransferase, pertencente ao cluster de genes do sistema tipo III de secreção de B. pseudomallei e um gene que codifica uma transposase ISBma2, uma sequência de inserção presente em cerca de 48 cópias e 6 cópias em B. mallei e B. pseudomallei, respectivamente. Deste modo, a amplificação e detecção de sinal por parte das sondas de hidrolisação dos dois genes alvo corresponde à identificação positiva de B. pseudomallei enquanto, a amplificação e detecção apenas do gene que codifica a transposase ISBma2 diz respeito a uma amostra positiva para B.mallei. Junto desta plataforma de diagnóstico, foi também construído um controlo interno de amplificação (IAC – Internal Amplification Control), pNZYmyx, clonando o fragmento de 125 pares de base do gene diplóide m000.5 L/R da estirpe Laussane do mixoma vírus no vector pNZY28. A finalidade deste controlo consiste em aferir se a reacção de PCR detém qualquer factor que resulte na inibição da reacção, afectando a amplificação dos genes alvo. A adaptação deste sistema de qPCR necessitou de optimização dos oligonucleotídeos necessários à reacção (iniciadores ou primers e sondas) bem como o ajuste da sua temperatura de hibridação (annealing) utilizando as estirpes de referência B. mallei NCTC 12938T e B. pseudomallei NCTC 12939T. Esta optimização de reacção foi executada com os dois alvos em separado (singleplex) e em conjunto (duplex), seguida de testes de especificidade, sensibilidade, repetibilidade e reprodutibilidade. Em singleplex, a concentração final óptima para cada alvo provou ser 400 nM enquanto que a concentração óptima das sondas de hidrolisação foram 100nM e 300 nM para ISBma2 e psu, respectivamente. As concentrações finais óptimas em duplex de primers e sonda para ambos os alvos foram, respectivamente, 400 nM e 200nM e a temperatura de annealing que demonstrou o Cq (Quantification Cycle) mais baixo foi de 58.1 ºC. A especificidade do sistema foi provada testando o qPCR com 17 microorganismos, incluindo Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeroginosa e a espécie geneticamente próxima, Burkholderia thailandensis, na qual o sinal de fluorescência foi somente detectado em B. mallei e B. pseudomallei. O sistema duplex qPCR provou ser capaz de detectar 29 fg e 455 fg de DNA de B. mallei e B. pseudomallei, respectivamente. O coeficiente de variação calculado para avaliar a repetibilidade e reprodutibilidade obteve valores máximos de 1.337% e de 2.288 %, respectivamente comprovando este sistema ser altamente repetível e reproduzível. A técnica de qPCR estabelecida foi capaz de identificar e distinguir os dois microorganismos em todas as matrizes inoculadas. No que diz respeito aos macerados pulmonares, o qPCR foi capaz de identificar correctamente os dois microorganismos até à diluição menos concentrada (10-6) detendo valores de Cq entre 15.93 (10-1) e 25.95 (10-6) em B. mallei e entre 23.44 (10-1 – alvo psu) e 38.18 (10-6 - alvo psu) para B. pseudomallei. Foi também possível identificar ambos agentes até à diluição menos concentradas para zaragatoas sem o passo de incubação, variando os valores de Cq entre 20.33 (10-1) e 39.25 (10-6) for B. mallei e entre 28.98 (10-1 - alvo psu) e 38.37 (10-6 - alvo psu) para B. pseudomallei. A adição prévia do passo de incubação para as zaragotoas demonstrou uma variação ligeira indicando com valores de Cq inferiores comparativamente às zaragatoas não incubadas. A detecção de B. pseudomallei em solos sem incubação prévia foi igualmente possível até à diluição menos concentrada. Porém, a análise de colónias isoladas provou ser altamente sensível, detectando todas as amostras com valores de Cq inferiores a 30. No entanto, o isolamento por cultura bacteriana (gold standard) provou ser um método de diagnóstico menos sensível comparando com o sistema de qPCR. A sensibilidade obtida por meio de cultura e qPCR para B. pseudomallei foi, respectivamente, 80% e 97% indicando uma baixa percentagem de falsos negativos para as duas metodologias, contudo, o método de qPCR é mais sensível mostrando ser capaz de identificar amostras consideradas negativas pelo método de cultura. Comparativamente, o método de qPCR para B.mallei mostrou ser 100% sensível ao identificar o microorganismo em todas as amostras enquanto que a sensibilidade do método de cultura para a isolação deste agente é significativamente menor, 17%, possivelmente devido à falta de um meio de cultura específico para o isolamento deste microorganismo. Desta forma, a identificação de B. mallei e B. pseudomallei por qPCR consiste num teste de diagnóstico sensível, específico, repetível e reprodutível capaz de identificar e diferenciar os dois agentes em amostras previamente inoculadas.