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Effects of environment and genetic backgroung on transposable element activity in Drosophila melanogaster

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Os transposões são sequência de ADN repetitivas que se replicam de forma independente e que são capazes de alterar a sua posição dentro do genoma hospedeiro. Estão presentes em todos os eucariotas estudados até à data e em cerca de 80% dos procariotas (Touchon et al. 2007), constituindo uma porção variável dos genomas, desde 1%, como no fungo Fusarium graminearum (Cuomo et al. 2007), até cerca de 85%, como nas espécies de milho Zea mays e Zea luxurians (Tenaillon et al. 2011, SanMiguel et al. 1996). Em humanos, os transposões constituem cerca 50% do genoma (Mills et al. 2007) e em Drosophila melanogaster cerca de 20% (Mukamel et al. 2013, Barr et al. 2014). Os transposões são geralmente classificados de acordo com o seu mecanismo de transposição, ou seja, como se movem dentro do genoma hospedeiro. Wicker et al. (2007) propuseram um sistema de classificação que se tornou consensual e no qual os transposões são divididos em duas classes. A Classe I compreende os retrotransposões, semelhantes a retrovírus e que transpõem através de um intermediário de ARN, são reconvertidos em ADN pela enzima Transcriptase Reversa e são reintegrados novamente no genoma, num mecanismo ao qual se designou transposição de copiar-e-colar. Os membros desta classe dividem-se em duas ordens – os LTRs, que possuem longas repetições terminais (long terminal repeats) e os não-LTRs, que não possuem essas sequências. A Classe II inclui os transposões de ADN, que utilizam um mecanismo de cortar-e-colar, não passando por um intermediário de ARN, e que possuem, na sua maioria, repetições terminais invertidas (TIRs, terminal inverted repeats)(Pray 2008). Quando se movem dentro do genoma, os transposões podem causar mutações que contribuem para a criação de novos variantes genéticos que podem servir de matéria prima para a evolução (Wagner et al. 2005). A transposição pode afetar a regulação de genes fornecendo, por exemplo, promotores novos, locais de splicing e sinais de poliadenilação (Cowley et al. 2013). Há dados que indicam um papel dos transposões na adaptação em populações naturais (González et al. 2008) e de laboratório (Sousa et al. 2013) e na evolução de caracteres novos (Bourque et al. 2008). Apesar de serem uma fonte de variação genética e inovação, a amplificação e mobilização de transposões tem geralmente efeitos prejudiciais ao hospedeiro, ao se inserirem em genes que codificam proteínas, alterando redes de regulação de transcrição e causando quebra de cromossomas e rearranjos genómicos a grande escala (McClintock 1951, Hedges et al. 2007). Para evitar estes efeitos, os organismos evoluíram mecanismos para reprimir e silenciar transposões, como os piARNs na linha germinal (Klattenhoff et al. 2007) e mecanismos epigenéticos como metilação e modificação da cromatina nas células somáticas (Slotkin et al. 2007). Drosophila melanogaster, também conhecida por mosca da fruta ou mosca do vinagre, é um sistema laboratorial modelo para estudos de genética e é também muito usada em investigação na área da biologia evolutiva e do desenvolvimento (Arbuthnoot et al. 2014, Campos et al. 2014, Tiwari et al. 2015). Existem várias ferramentas genéticas disponíveis para este organismo, inclusivamente para o estudo dos transposões que se encontram inseridos no seu genoma. Um desses recursos é o Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) (Mackay et al. 2012, Huang et al. 2014), que consiste num conjunto de cerca de 200 linhas isogénicas completamente sequenciadas, provenientes de uma única população natural. Através de anotação in silico das sequências genómicas, conhece-se a posição e identidade dos transposões inseridos nessas linhas. Apesar dos grandes avanços que têm sido feitos no sentido de caracterizar transposões e de se descobrirem mecanismos que os silenciem e/ou controlem a sua expressão, tanto nas células da linha germinal como em tecidos unicamente somáticos, ainda não se sabe ao certo o que aciona e altera a transposição dos transposões. No entanto, é reconhecido que, como em muitos outros processos biológicos, a ativação destes elementos pode ser afetada por fatores genéticos e ambientais (Capi et al. 2000). A temperatura é um fator ambiental importante que afeta o fitness do organismo a nível de fecundidade, viabilidade e sobrevivência (Allen et al. 2011, Stoks et al. 2011, Ciota et al. 2014). Em plantas, sabe-se que o aumento da temperatura pode levar a um aumento da expressão dos transposões (Grandbastien et al. 2005). Por outro lado, em Drosophila melanogaster, os estudos têm sido inconclusivos, havendo experiências onde o aumento de temperatura afeta e amplifica a expressão dos transposões (Zabanov et al. 1990, Vasilyeva et al. 1999, Bubenshchikova et al. 2002) e outras onde não se vê qualquer efeito (Arnault et al. 1997, Alonso-González et al. 2006, Vázquez et al. 2007). Um outro fator ambiental potencialmente relevante é a presença da bactéria Wolbachia, maternalmente transmitida e presente em muitas espécies de insetos, crustáceos e nematodes filamentosos (Stouthamer et al. 1999). Este simbionte confere resistência a vírus em Drosophila melanogaster (Teixeira et al. 2008, Hedges et al. 2008) e, tendo em conta que muitos transposões possuem características semelhantes às dos vírus (Schaack et al. 2010, Xiong and Eickbush, 1988), é possível que este simbionte confira também alguma proteção contra transposões. Nesta dissertação, utilizámos linhas DGRP para estudar potenciais efeitos do genótipo e dos fatores ambientais acima descritos na atividade dos transposões de Drosophila melanogaster. Focámos o estudo na expressão de transposões nos ovários, pois é na linha germinal que alterações na atividade destes elementos poderão ser herdadas pela geração seguinte e contribuir para a variação genética da população. O nosso primeiro objetivo foi validar as previsões feitas in silico para as linhas do DGRP relativamente à localização e identidade das inserções de transposões. Para isso, sequenciámos várias inserções do painel e confirmámos a posição e identidade para a maioria dessas inserções. Isto nunca tinha sido testado e os nossos resultados conferem alguma robustez às previsões in silico feitas para o painel para que possam ser usadas com maior confiança em estudos futuros. De seguida, procurámos verificar se haveria alguma associação entre a expressão dos transposões e o número de cópias desses elementos, dentro de várias linhas do DGRP, questionando se o número de cópias poderia explicar níveis de expressão. Observámos diferenças evidentes entre genótipos na expressão de alguns mas não todos os transposões. Também observámos que as diferenças entre os genótipos para um mesmo transposão não podiam ser explicadas pelo número de inserções. Finalmente, testámos os efeitos da temperatura e Wolbachia, em várias linhas DGRP, na expressão de transposões e concluímos que ambos os fatores ambientais afetam a expressão destes elementos, embora a forma como são afetados varie de acordo com o transposão e com o genótipo. A temperatura poderá estar a afetar transposões que se encontrem sob o efeito de enhancers ou fatores de transcrição sensíveis a temperatura ou a afetar os mecanismos de repressão dos transposões, como os piARNs. Tal podia ser testado procurando-se enhancers e fatores de transcrição cujas sequências estejam anotadas em bases de dados. Podia-se também sequenciar piARNs de uma linha do DGRP após ter sido sujeita a diferentes condições de temperatura e verificar se quando há efeito da temperatura também há alteração nos piARNs. Não se sabe ainda como é que Wolbachia confere resistência a vírus e, consequentemente, como poderá estar a afetar a expressão dos transposões. Para testar se o efeito de Wolbachia está relacionado com os mecanismos de repressão dos transposões poder-se-iam comparar piARNs de ovários de uma linha infetada com Wolbachia e piRNAs da mesma linha mas na qual Wolbachia fora removida. Tendo em conta que as observações feitas neste estudo foram focadas em ovários, seria também interessante testar tecidos da linha germinal masculina (testículos) e em tecidos unicamente somáticos (como os dos tóraxes) para compreendermos se os efeitos ambientais sobre os transposões são específicos de um tecido ou se é um efeito geral, afetando todo o corpo do organismo. Pensamos que é de esperar o favorecimento de um mecanismo que beneficie a geração de variabilidade genética na descendência, em caso de perturbação ambiental, pois alguns desses variantes genéticos poderão ter melhor capacidade de sobrevivência e reprodução nas novas condições ambientais.
Autores principais:	Eugénio, Ana Teresa Mendes
Assunto:	Variação genética Efeitos do fundo genético Efeitos ambientais Expressão de transposões Teses de mestrado - 2015
Ano:	2015
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Os transposões são sequência de ADN repetitivas que se replicam de forma independente e que são capazes de alterar a sua posição dentro do genoma hospedeiro. Estão presentes em todos os eucariotas estudados até à data e em cerca de 80% dos procariotas (Touchon et al. 2007), constituindo uma porção variável dos genomas, desde 1%, como no fungo Fusarium graminearum (Cuomo et al. 2007), até cerca de 85%, como nas espécies de milho Zea mays e Zea luxurians (Tenaillon et al. 2011, SanMiguel et al. 1996). Em humanos, os transposões constituem cerca 50% do genoma (Mills et al. 2007) e em Drosophila melanogaster cerca de 20% (Mukamel et al. 2013, Barr et al. 2014). Os transposões são geralmente classificados de acordo com o seu mecanismo de transposição, ou seja, como se movem dentro do genoma hospedeiro. Wicker et al. (2007) propuseram um sistema de classificação que se tornou consensual e no qual os transposões são divididos em duas classes. A Classe I compreende os retrotransposões, semelhantes a retrovírus e que transpõem através de um intermediário de ARN, são reconvertidos em ADN pela enzima Transcriptase Reversa e são reintegrados novamente no genoma, num mecanismo ao qual se designou transposição de copiar-e-colar. Os membros desta classe dividem-se em duas ordens – os LTRs, que possuem longas repetições terminais (long terminal repeats) e os não-LTRs, que não possuem essas sequências. A Classe II inclui os transposões de ADN, que utilizam um mecanismo de cortar-e-colar, não passando por um intermediário de ARN, e que possuem, na sua maioria, repetições terminais invertidas (TIRs, terminal inverted repeats)(Pray 2008). Quando se movem dentro do genoma, os transposões podem causar mutações que contribuem para a criação de novos variantes genéticos que podem servir de matéria prima para a evolução (Wagner et al. 2005). A transposição pode afetar a regulação de genes fornecendo, por exemplo, promotores novos, locais de splicing e sinais de poliadenilação (Cowley et al. 2013). Há dados que indicam um papel dos transposões na adaptação em populações naturais (González et al. 2008) e de laboratório (Sousa et al. 2013) e na evolução de caracteres novos (Bourque et al. 2008). Apesar de serem uma fonte de variação genética e inovação, a amplificação e mobilização de transposões tem geralmente efeitos prejudiciais ao hospedeiro, ao se inserirem em genes que codificam proteínas, alterando redes de regulação de transcrição e causando quebra de cromossomas e rearranjos genómicos a grande escala (McClintock 1951, Hedges et al. 2007). Para evitar estes efeitos, os organismos evoluíram mecanismos para reprimir e silenciar transposões, como os piARNs na linha germinal (Klattenhoff et al. 2007) e mecanismos epigenéticos como metilação e modificação da cromatina nas células somáticas (Slotkin et al. 2007). Drosophila melanogaster, também conhecida por mosca da fruta ou mosca do vinagre, é um sistema laboratorial modelo para estudos de genética e é também muito usada em investigação na área da biologia evolutiva e do desenvolvimento (Arbuthnoot et al. 2014, Campos et al. 2014, Tiwari et al. 2015). Existem várias ferramentas genéticas disponíveis para este organismo, inclusivamente para o estudo dos transposões que se encontram inseridos no seu genoma. Um desses recursos é o Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) (Mackay et al. 2012, Huang et al. 2014), que consiste num conjunto de cerca de 200 linhas isogénicas completamente sequenciadas, provenientes de uma única população natural. Através de anotação in silico das sequências genómicas, conhece-se a posição e identidade dos transposões inseridos nessas linhas. Apesar dos grandes avanços que têm sido feitos no sentido de caracterizar transposões e de se descobrirem mecanismos que os silenciem e/ou controlem a sua expressão, tanto nas células da linha germinal como em tecidos unicamente somáticos, ainda não se sabe ao certo o que aciona e altera a transposição dos transposões. No entanto, é reconhecido que, como em muitos outros processos biológicos, a ativação destes elementos pode ser afetada por fatores genéticos e ambientais (Capi et al. 2000). A temperatura é um fator ambiental importante que afeta o fitness do organismo a nível de fecundidade, viabilidade e sobrevivência (Allen et al. 2011, Stoks et al. 2011, Ciota et al. 2014). Em plantas, sabe-se que o aumento da temperatura pode levar a um aumento da expressão dos transposões (Grandbastien et al. 2005). Por outro lado, em Drosophila melanogaster, os estudos têm sido inconclusivos, havendo experiências onde o aumento de temperatura afeta e amplifica a expressão dos transposões (Zabanov et al. 1990, Vasilyeva et al. 1999, Bubenshchikova et al. 2002) e outras onde não se vê qualquer efeito (Arnault et al. 1997, Alonso-González et al. 2006, Vázquez et al. 2007). Um outro fator ambiental potencialmente relevante é a presença da bactéria Wolbachia, maternalmente transmitida e presente em muitas espécies de insetos, crustáceos e nematodes filamentosos (Stouthamer et al. 1999). Este simbionte confere resistência a vírus em Drosophila melanogaster (Teixeira et al. 2008, Hedges et al. 2008) e, tendo em conta que muitos transposões possuem características semelhantes às dos vírus (Schaack et al. 2010, Xiong and Eickbush, 1988), é possível que este simbionte confira também alguma proteção contra transposões. Nesta dissertação, utilizámos linhas DGRP para estudar potenciais efeitos do genótipo e dos fatores ambientais acima descritos na atividade dos transposões de Drosophila melanogaster. Focámos o estudo na expressão de transposões nos ovários, pois é na linha germinal que alterações na atividade destes elementos poderão ser herdadas pela geração seguinte e contribuir para a variação genética da população. O nosso primeiro objetivo foi validar as previsões feitas in silico para as linhas do DGRP relativamente à localização e identidade das inserções de transposões. Para isso, sequenciámos várias inserções do painel e confirmámos a posição e identidade para a maioria dessas inserções. Isto nunca tinha sido testado e os nossos resultados conferem alguma robustez às previsões in silico feitas para o painel para que possam ser usadas com maior confiança em estudos futuros. De seguida, procurámos verificar se haveria alguma associação entre a expressão dos transposões e o número de cópias desses elementos, dentro de várias linhas do DGRP, questionando se o número de cópias poderia explicar níveis de expressão. Observámos diferenças evidentes entre genótipos na expressão de alguns mas não todos os transposões. Também observámos que as diferenças entre os genótipos para um mesmo transposão não podiam ser explicadas pelo número de inserções. Finalmente, testámos os efeitos da temperatura e Wolbachia, em várias linhas DGRP, na expressão de transposões e concluímos que ambos os fatores ambientais afetam a expressão destes elementos, embora a forma como são afetados varie de acordo com o transposão e com o genótipo. A temperatura poderá estar a afetar transposões que se encontrem sob o efeito de enhancers ou fatores de transcrição sensíveis a temperatura ou a afetar os mecanismos de repressão dos transposões, como os piARNs. Tal podia ser testado procurando-se enhancers e fatores de transcrição cujas sequências estejam anotadas em bases de dados. Podia-se também sequenciar piARNs de uma linha do DGRP após ter sido sujeita a diferentes condições de temperatura e verificar se quando há efeito da temperatura também há alteração nos piARNs. Não se sabe ainda como é que Wolbachia confere resistência a vírus e, consequentemente, como poderá estar a afetar a expressão dos transposões. Para testar se o efeito de Wolbachia está relacionado com os mecanismos de repressão dos transposões poder-se-iam comparar piARNs de ovários de uma linha infetada com Wolbachia e piRNAs da mesma linha mas na qual Wolbachia fora removida. Tendo em conta que as observações feitas neste estudo foram focadas em ovários, seria também interessante testar tecidos da linha germinal masculina (testículos) e em tecidos unicamente somáticos (como os dos tóraxes) para compreendermos se os efeitos ambientais sobre os transposões são específicos de um tecido ou se é um efeito geral, afetando todo o corpo do organismo. Pensamos que é de esperar o favorecimento de um mecanismo que beneficie a geração de variabilidade genética na descendência, em caso de perturbação ambiental, pois alguns desses variantes genéticos poderão ter melhor capacidade de sobrevivência e reprodução nas novas condições ambientais.