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Synthesis of new antibiotic glycosides and computational studies on their interaction with model lipid bilayers

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A descoberta de novos antibióticos que apresentem mecanismos de ação inovadores representa um dos principais desafios que a comunidade científica enfrenta, sobretudo devido à disseminação crescente de estirpes bacterianas resistentes às terapêuticas disponíveis. Neste contexto, o nosso grupo de investigação está particularmente interessado em explorar a potencial utilidade terapêutica de surfactantes derivados de açúcares enquanto agentes antibacterianos. Estas moléculas são conhecidas pela sua biocompatibilidade e por apresentarem baixa toxicidade ecológica, pelo que se consideram apropriadas para aplicações em medicina e na indústria. Em trabalhos anteriores, descrevemos uma série de 2-desoxi-/2,6-didesoxi-arabino-hexopiranósidos de alquilo [1–3], alguns dos quais exibiram actividades antibacterianas potentes e seletivas quando testadas em estirpes de Bacillus, nomeadamente B. cereus, B. subtilis e, em particular, B. anthracis, sendo o último considerado um agente de bioterrorismo. No entanto, o composto mais potente, 2,6-didesoxy-arabino-hexopiranósido de dodecilo, revelou também induzir toxicidade aguda em linfócitos humanos. Assim, considerámos relevante proceder com a otimização desta estrutura, perspectivando, por um lado, vir a alcançar um candidato a fármaco potencialmente não tóxico e, por outro, aprofundar o nosso conhecimento no que diz respeito às características estruturais que determinam a sua bioactividade. Os dados por nós obtidos sobre a actividade superficial destes compostos, bem como estudos biológicos preliminares que realizámos, sugerem um mecanismo de ação que deverá envolver a associação de glicósidos em agregados micelares em solução e a interação destas estruturas com as membranas celulares bacterianas, de forma semelhante à acção de detergentes. No entanto, as interações moleculares que conduzem a estes fenómenos ainda não foram elucidadas. Neste trabalho, procurámos contribuir para esta investigação em curso por via de uma abordagem interdisciplinar, nomeadamente através do (i) design, síntese e subsequente avaliação da actividade antibacteriana de desoxiglicósidos análogos ao composto líder, e de um (ii) estudo computacional centrado na interação dos mesmos compostos com um modelo de bicamada lipídica. O racional para a síntese de novos desoxiglicósidos de dodecilo relationados com o composto líder foi concebido com o intuito de explorar o eventual impacto biológico de modificações estruturais específicas, nomeadamente a substituição de um átomo de hidrogénio na posição 2 do açúcar por um grupo hidroxilo (para a formação de um 6-desoxiglicósido) ou por um átomo de flúor (para a formação de 2,6-didesoxi-2-fluoroglicósidos) e, em alternativa, a substituição de grupo metilo na posição 6 por um átomo de hidrogénio (para a formação de 2-desoxipentopiranósidos). Por conseguinte, a sua preparação envolveu necessariamente estratégias distintas. A síntese de _-l-rhamnopiranósido de dodecilo (6-desoxi-_-l-mannopiranósido de dodecilo) foi conseguida através da glicosilação estereoseletiva do precursor tricloroacetimidato peracetilado (que foi obtido de forma simples e eficiente a partir da l-rhamnose, em três passos) catalizada pelo triflato de trimetilsililo, seguida de uma reação de desacetilação (rendimento de 85% para os dois passos). Os compostos-alvo desoxigenados e/ou fluorados na posição 2 do açúcar, por sua vez, foram preparados utilizando glicais como materiais de partida. Assim, novos 2-desoxi-e-l-threo-pentopiranósidos de dodecilo foram também sintetizados, desta vez por via da reação do l-xilal peracetilado (obtido a partir da l-xilose em três passos por via de metodologias convencionais) com dodecanol catalisada por hidrobrometo de trifenilfosfónio e subsequente reacção de desproteção. A reação de glicosilação originou os correspondentes anómeros _ e _ com rendimentos de 23% e 10%, respectivamente, e foram ainda isoladas quantidades consideráveis de glicósidos 2,3-insaturados (rendimento total de 27%), que se formam por rearranjo alílico e concomitante eliminação de ácido acético em meio ácido. Esta metodologia merece pois optimização futura com vista a promover a conversão selectiva dos intermediários saturados, por exemplo através da utilização de éteres benzílicos como grupos protetores uma vez que estes são em geral mais estáveis em meio ácido. Curiosamente, verificou-se que o anómero _ assume um comportamento conformacional atípico, dependendo do solvente, que foi possível racionalizar combinando análise por NMR e cálculos quânticos (DFT). Finalmente, preparámos vários 2,6-didesoxi-2-fluoroglicósidos de dodecilo através da fluoração eletrófila e simultânea adição nucleófila de dodecanol a derivados protegidos do 6-desoxi-l-glucal, que ocorrem na presença de selectfluor, e subsequente reação de desproteção. Quando a reação foi conduzida usando o glical peracetilado, disponível comercialmente, obtiveram-se os glicósidos exibindo configuração _-l-gluco e _-l-manno com um rendimento de 37% (sob a forma de uma mistura inseparávelde epímeros), e o glicósido exibindo configuração _-l-gluco com um rendimento de 5%. Por sua vez, a reação a partir do glical sililado (que foi previamente sintetizado partindo do glical acetilado correspondente por desacetilação e subsequente sililação, num único passo) promoveu a formação preferencial dos estereoisómeros exibindo configuração gluco, tendo sido isolados os _-l-gluco- e _-l-gluco-glicósidos com um rendimento de 27% (desta vez sob a forma de uma mistura inseparável de anómeros), e o _-l-manno-glicósido com um rendimento de 7%. No que diz respeito à actividade antibacteriana destes compostos, quando determinada pelo método de diluição em meio líquido, verificou-se que o 6-desoxiglicósido e os 2-desoxipentopiranósidos apresentam actividades moderadas quando testados contra B. cereus (CMI = 32 μg mL-1). Por outro lado, os 2,6-didesoxi-2-fluoro-_-l-glicósidos revelaram ser os compostos mais activos, apresentando uma actividade antibacteriana competitiva com a exibida pelo composto líder (CMI = 16 μg mL-1), enquanto que o estereoisómero _-gluco não foi de todo activo na gama de concentrações testada. Alguns dos compostos sintetizados, nomeadamente aqueles que não apresentam um átomo de flúor na sua estrutura, foram ainda testados no que se refere à inibição de B. anthracis, neste caso utilizando o método de diluição em meio sólido. Verificou-se que todos estes compostos são inibidores potentes deste agente patogénico e, por consequência, consideramos particularmente relevante a sua potencial aplicação também no contexto da segurança biológica. As simulações de dinâmica molecular têm sido bastante utilizadas enquanto método para explorar as propriedades estruturais e dinâmicas de uma variedade de sistemas amfifílicos, incluindo micelas de surfactantes e bicamadas lipídicas, assim como para investigar fenómenos intermoleculares importantes, tais como interações fármaco-membrana. Neste contexto, realizámos um estudo de dinâmica molecular com o objectivo de estudar esta família de desoxiglicósidos de alquilo, incluindo alguns dos sintetizados no âmbito desta dissertação, na perspectiva contribuir para a elucidação do seu mecanismo de ação. Os nossos resultados confirmam que estes glicósidos formam micelas estáveis em solução aquosa, em concordância com os dados experimentais que se conhecem relativamente à sua actividade superficial. Verificou-se ainda que essas micelas interagem fortemente com um modelo de membrana na sua vizinhança, tendo sido observados vários eventos de partição e/ou fusão micela-membrana, indicando uma preferência clara para a fase lipídica. Também foi estudado o efeito destas moléculas sobre uma bicamada lipídica, em função da sua concentração. Este estudo demonstrou que tanto a ordem das cadeias hidrocarbonadas dos fosfolípidos como a espessura da bicamada aumentam quando a concentração de glicósido é aumentada. Estas alterações biofísicas, que correspondem a uma eventual diminuição da fluidez membranar, poderão ter um impacto significativo na integridade estrutural de uma membrana biológica. Consideramos portanto este resultado particularmente importante, uma vez que estudos preliminares por nós realizados sugerem que o mecanismo de ação destes glicósidos surfactantes não deverá envolver a formação/estabilização de poros membranares. Em suma, o trabalho realizado demonstra que esta família de desoxiglicósidos inclui vários compostos que apresentam actividades antibacterianas muito potentes e cujo mecanismo de acção deverá ser diferente daqueles que se conhecem para outras classes de antibióticos. Sugerimos pois um mecanismo baseado na ordenação dos fosfolípidos de membrana como consequência da partição de glicósidos.
Autores principais:	Nunes, Rafael de Santana
Assunto:	Antibióticos Glicósidos surfactantes Glicosilação Dinâmica molecular Bicamadas lipídicas Teses de mestrado - 2015
Ano:	2015
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A descoberta de novos antibióticos que apresentem mecanismos de ação inovadores representa um dos principais desafios que a comunidade científica enfrenta, sobretudo devido à disseminação crescente de estirpes bacterianas resistentes às terapêuticas disponíveis. Neste contexto, o nosso grupo de investigação está particularmente interessado em explorar a potencial utilidade terapêutica de surfactantes derivados de açúcares enquanto agentes antibacterianos. Estas moléculas são conhecidas pela sua biocompatibilidade e por apresentarem baixa toxicidade ecológica, pelo que se consideram apropriadas para aplicações em medicina e na indústria. Em trabalhos anteriores, descrevemos uma série de 2-desoxi-/2,6-didesoxi-arabino-hexopiranósidos de alquilo [1–3], alguns dos quais exibiram actividades antibacterianas potentes e seletivas quando testadas em estirpes de Bacillus, nomeadamente B. cereus, B. subtilis e, em particular, B. anthracis, sendo o último considerado um agente de bioterrorismo. No entanto, o composto mais potente, 2,6-didesoxy-arabino-hexopiranósido de dodecilo, revelou também induzir toxicidade aguda em linfócitos humanos. Assim, considerámos relevante proceder com a otimização desta estrutura, perspectivando, por um lado, vir a alcançar um candidato a fármaco potencialmente não tóxico e, por outro, aprofundar o nosso conhecimento no que diz respeito às características estruturais que determinam a sua bioactividade. Os dados por nós obtidos sobre a actividade superficial destes compostos, bem como estudos biológicos preliminares que realizámos, sugerem um mecanismo de ação que deverá envolver a associação de glicósidos em agregados micelares em solução e a interação destas estruturas com as membranas celulares bacterianas, de forma semelhante à acção de detergentes. No entanto, as interações moleculares que conduzem a estes fenómenos ainda não foram elucidadas. Neste trabalho, procurámos contribuir para esta investigação em curso por via de uma abordagem interdisciplinar, nomeadamente através do (i) design, síntese e subsequente avaliação da actividade antibacteriana de desoxiglicósidos análogos ao composto líder, e de um (ii) estudo computacional centrado na interação dos mesmos compostos com um modelo de bicamada lipídica. O racional para a síntese de novos desoxiglicósidos de dodecilo relationados com o composto líder foi concebido com o intuito de explorar o eventual impacto biológico de modificações estruturais específicas, nomeadamente a substituição de um átomo de hidrogénio na posição 2 do açúcar por um grupo hidroxilo (para a formação de um 6-desoxiglicósido) ou por um átomo de flúor (para a formação de 2,6-didesoxi-2-fluoroglicósidos) e, em alternativa, a substituição de grupo metilo na posição 6 por um átomo de hidrogénio (para a formação de 2-desoxipentopiranósidos). Por conseguinte, a sua preparação envolveu necessariamente estratégias distintas. A síntese de _-l-rhamnopiranósido de dodecilo (6-desoxi-_-l-mannopiranósido de dodecilo) foi conseguida através da glicosilação estereoseletiva do precursor tricloroacetimidato peracetilado (que foi obtido de forma simples e eficiente a partir da l-rhamnose, em três passos) catalizada pelo triflato de trimetilsililo, seguida de uma reação de desacetilação (rendimento de 85% para os dois passos). Os compostos-alvo desoxigenados e/ou fluorados na posição 2 do açúcar, por sua vez, foram preparados utilizando glicais como materiais de partida. Assim, novos 2-desoxi-e-l-threo-pentopiranósidos de dodecilo foram também sintetizados, desta vez por via da reação do l-xilal peracetilado (obtido a partir da l-xilose em três passos por via de metodologias convencionais) com dodecanol catalisada por hidrobrometo de trifenilfosfónio e subsequente reacção de desproteção. A reação de glicosilação originou os correspondentes anómeros _ e _ com rendimentos de 23% e 10%, respectivamente, e foram ainda isoladas quantidades consideráveis de glicósidos 2,3-insaturados (rendimento total de 27%), que se formam por rearranjo alílico e concomitante eliminação de ácido acético em meio ácido. Esta metodologia merece pois optimização futura com vista a promover a conversão selectiva dos intermediários saturados, por exemplo através da utilização de éteres benzílicos como grupos protetores uma vez que estes são em geral mais estáveis em meio ácido. Curiosamente, verificou-se que o anómero _ assume um comportamento conformacional atípico, dependendo do solvente, que foi possível racionalizar combinando análise por NMR e cálculos quânticos (DFT). Finalmente, preparámos vários 2,6-didesoxi-2-fluoroglicósidos de dodecilo através da fluoração eletrófila e simultânea adição nucleófila de dodecanol a derivados protegidos do 6-desoxi-l-glucal, que ocorrem na presença de selectfluor, e subsequente reação de desproteção. Quando a reação foi conduzida usando o glical peracetilado, disponível comercialmente, obtiveram-se os glicósidos exibindo configuração _-l-gluco e _-l-manno com um rendimento de 37% (sob a forma de uma mistura inseparávelde epímeros), e o glicósido exibindo configuração _-l-gluco com um rendimento de 5%. Por sua vez, a reação a partir do glical sililado (que foi previamente sintetizado partindo do glical acetilado correspondente por desacetilação e subsequente sililação, num único passo) promoveu a formação preferencial dos estereoisómeros exibindo configuração gluco, tendo sido isolados os _-l-gluco- e _-l-gluco-glicósidos com um rendimento de 27% (desta vez sob a forma de uma mistura inseparável de anómeros), e o _-l-manno-glicósido com um rendimento de 7%. No que diz respeito à actividade antibacteriana destes compostos, quando determinada pelo método de diluição em meio líquido, verificou-se que o 6-desoxiglicósido e os 2-desoxipentopiranósidos apresentam actividades moderadas quando testados contra B. cereus (CMI = 32 μg mL-1). Por outro lado, os 2,6-didesoxi-2-fluoro-_-l-glicósidos revelaram ser os compostos mais activos, apresentando uma actividade antibacteriana competitiva com a exibida pelo composto líder (CMI = 16 μg mL-1), enquanto que o estereoisómero _-gluco não foi de todo activo na gama de concentrações testada. Alguns dos compostos sintetizados, nomeadamente aqueles que não apresentam um átomo de flúor na sua estrutura, foram ainda testados no que se refere à inibição de B. anthracis, neste caso utilizando o método de diluição em meio sólido. Verificou-se que todos estes compostos são inibidores potentes deste agente patogénico e, por consequência, consideramos particularmente relevante a sua potencial aplicação também no contexto da segurança biológica. As simulações de dinâmica molecular têm sido bastante utilizadas enquanto método para explorar as propriedades estruturais e dinâmicas de uma variedade de sistemas amfifílicos, incluindo micelas de surfactantes e bicamadas lipídicas, assim como para investigar fenómenos intermoleculares importantes, tais como interações fármaco-membrana. Neste contexto, realizámos um estudo de dinâmica molecular com o objectivo de estudar esta família de desoxiglicósidos de alquilo, incluindo alguns dos sintetizados no âmbito desta dissertação, na perspectiva contribuir para a elucidação do seu mecanismo de ação. Os nossos resultados confirmam que estes glicósidos formam micelas estáveis em solução aquosa, em concordância com os dados experimentais que se conhecem relativamente à sua actividade superficial. Verificou-se ainda que essas micelas interagem fortemente com um modelo de membrana na sua vizinhança, tendo sido observados vários eventos de partição e/ou fusão micela-membrana, indicando uma preferência clara para a fase lipídica. Também foi estudado o efeito destas moléculas sobre uma bicamada lipídica, em função da sua concentração. Este estudo demonstrou que tanto a ordem das cadeias hidrocarbonadas dos fosfolípidos como a espessura da bicamada aumentam quando a concentração de glicósido é aumentada. Estas alterações biofísicas, que correspondem a uma eventual diminuição da fluidez membranar, poderão ter um impacto significativo na integridade estrutural de uma membrana biológica. Consideramos portanto este resultado particularmente importante, uma vez que estudos preliminares por nós realizados sugerem que o mecanismo de ação destes glicósidos surfactantes não deverá envolver a formação/estabilização de poros membranares. Em suma, o trabalho realizado demonstra que esta família de desoxiglicósidos inclui vários compostos que apresentam actividades antibacterianas muito potentes e cujo mecanismo de acção deverá ser diferente daqueles que se conhecem para outras classes de antibióticos. Sugerimos pois um mecanismo baseado na ordenação dos fosfolípidos de membrana como consequência da partição de glicósidos.