Publicação
Estudo das "Hybrid Cluster Proteins" de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough
| Resumo: | As Hybrid Cluster Proteins são proteínas de ferro‐enxofre que apresentam propriedades muito particulares como possuir um cluster único (hybrid cluster), e serem descritas como tendo atividade de hidroxilamina redutase. Contudo o seu papel in vivo nas bactérias onde ocorrem não foi ainda esclarecido. Em Desulfovibrio Vulgaris Hildenborough existem duas Hcp’s, Hcp1 e a Hcp2, que apresentam elevada homologia da sequencia proteica e cuja função e ainda desconhecida. Neste trabalho estudou‐se o papel das Hcp’s de D. vulgaris Hildenborough na resposta ao stress causado pelo oxigénio atmosférico, pelo peroxido de hidrogénio e pelo oxido nítrico. No stress com oxigénio e com peroxido não se observaram diferenças na viabilidade dos mutantes para os genes hcp1 e hcp2 em relação a estirpe selvagem. Os ensaios de complementação em Escherichia coli LMS2710 (estirpe mutada numa redutase de nitrogénio) realizados com os genes hcp1 e hcp2 indicam também que as duas proteínas não contribuem para a resistência de D. vulgaris Hildenborough a este stress. Assim os dados obtidos mostram que estes genes não tem função nestas condições. Averiguou‐se o papel dos genes roo1 e roo2 de D. vulgaris Hildenborough que codificam duas proteínas flavodiiron que estão propostas estar envolvidas na destoxificação do óxido nítrico. Verificou‐se que a expressão da Roo1 e capaz de complementar a mutação da estirpe de Escherichia coli referida (deletada na redutase de nitrogénio). Contudo as estirpes de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough mutadas em hcp1 e hcp2, quando submetidas a stress pelo NO, não mostraram diferenças de viabilidade quando comparadas com a estirpe selvagem nas mesmas condições. Outro objetivo deste trabalho foi avaliar a afinidade do regulador HcpR para as zonas promotoras de hcp1 e hcp2. Para isso procedeu‐se a clonagem do gene hcpR de D.vulgaris Hildenborough em pET28a e a expressão e purificação da proteína recombinante. Realizaram‐se ensaios de Electrophoretic Mobility Shift Assay não só com estas zonas promotoras, mas também zonas promotoras dos genes flavodoxina (fld), ferrous iron transporter (feoA) e alkyl hydroperoxide reductase C (ahpC) de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough que são descritos como sendo regulados pela HcpR. Embora se tenha observado a alteração da mobilidade das sondas hcp1, hcp2 e feoA na presença de HcpR, apenas para hcp2 foi possível demonstrar que a mobilidade varia com o aumento da quantidade de proteína. Foi assim possível provar a ligação do regulador HcpR a zona promotora do gene hcp2. |
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| Autores principais: | Pereira, Fábio Alexandre Paulino |
| Assunto: | Hybrid Cluster Proteins hcp1 hcp2 roo1 roo2 HcpR Oxigénio Peróxido de hidrogénio Óxido nítrico EMSA Teses de mestrado - 2012 |
| Ano: | 2012 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | português |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | As Hybrid Cluster Proteins são proteínas de ferro‐enxofre que apresentam propriedades muito particulares como possuir um cluster único (hybrid cluster), e serem descritas como tendo atividade de hidroxilamina redutase. Contudo o seu papel in vivo nas bactérias onde ocorrem não foi ainda esclarecido. Em Desulfovibrio Vulgaris Hildenborough existem duas Hcp’s, Hcp1 e a Hcp2, que apresentam elevada homologia da sequencia proteica e cuja função e ainda desconhecida. Neste trabalho estudou‐se o papel das Hcp’s de D. vulgaris Hildenborough na resposta ao stress causado pelo oxigénio atmosférico, pelo peroxido de hidrogénio e pelo oxido nítrico. No stress com oxigénio e com peroxido não se observaram diferenças na viabilidade dos mutantes para os genes hcp1 e hcp2 em relação a estirpe selvagem. Os ensaios de complementação em Escherichia coli LMS2710 (estirpe mutada numa redutase de nitrogénio) realizados com os genes hcp1 e hcp2 indicam também que as duas proteínas não contribuem para a resistência de D. vulgaris Hildenborough a este stress. Assim os dados obtidos mostram que estes genes não tem função nestas condições. Averiguou‐se o papel dos genes roo1 e roo2 de D. vulgaris Hildenborough que codificam duas proteínas flavodiiron que estão propostas estar envolvidas na destoxificação do óxido nítrico. Verificou‐se que a expressão da Roo1 e capaz de complementar a mutação da estirpe de Escherichia coli referida (deletada na redutase de nitrogénio). Contudo as estirpes de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough mutadas em hcp1 e hcp2, quando submetidas a stress pelo NO, não mostraram diferenças de viabilidade quando comparadas com a estirpe selvagem nas mesmas condições. Outro objetivo deste trabalho foi avaliar a afinidade do regulador HcpR para as zonas promotoras de hcp1 e hcp2. Para isso procedeu‐se a clonagem do gene hcpR de D.vulgaris Hildenborough em pET28a e a expressão e purificação da proteína recombinante. Realizaram‐se ensaios de Electrophoretic Mobility Shift Assay não só com estas zonas promotoras, mas também zonas promotoras dos genes flavodoxina (fld), ferrous iron transporter (feoA) e alkyl hydroperoxide reductase C (ahpC) de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough que são descritos como sendo regulados pela HcpR. Embora se tenha observado a alteração da mobilidade das sondas hcp1, hcp2 e feoA na presença de HcpR, apenas para hcp2 foi possível demonstrar que a mobilidade varia com o aumento da quantidade de proteína. Foi assim possível provar a ligação do regulador HcpR a zona promotora do gene hcp2. |
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