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Viruses as a source of antiviral peptide-based drugs

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As patologias causadas por infeções contribuem consideravelmente para o número total de mortes que ocorrem mundialmente. Segundo a organização mundial de saúde, o vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1 (VIH-1) é responsável por cerca de 2.7% destas infeções. O VIH-1 foi identificado em 1981 e pertence, de acordo com a classificação de Baltimore, ao grupo dos vírus de cadeia simples de RNA com DNA intermediário (ssRNA-RT), fazendo parte da família Retroviridae e género Lentivirus. Este retrovírus é o responsável pela síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) e a sua infeção é caracterizada por causar uma rápida depleção na população de linfócitos T CD4+ do hospedeiro, tornando-o imunocomprometido e vulnerável a infeções oportunistas. Apesar dos esforços da comunidade científica ao longo dos anos, ainda não existe uma vacina ou tratamento totalmente eficaz. Atualmente os tratamentos disponíveis incluem vários medicamentos aprovados para uso clínico e aumentaram significativamente a esperança de vida dos pacientes infetados. O tratamento anti-retroviral (TARV) consiste num regime triplo de fármacos dirigidos a, pelo menos, dois alvos moleculares distintos e hoje em dia, é aceite como a forma mais eficaz de controlar a virémia. No entanto, o potencial deste tipo de terapia é limitado pelo desenvolvimento da resistência do VIH-1 aos fármacos. Assim, o estudo continuado de novos medicamentos eficazes é fundamental para combater estirpes que se tornam resistentes. O desenvolvimento de novos medicamentos peptídicos tem vindo a aumentar nos últimos anos. Os péptidos, tipicamente constituídos por sequências de 2 a 50 resíduos de aminoácidos, podem ser encontrados naturalmente em diferentes organismos onde desempenham várias funções nomeadamente como parte integrante do sistema imunitário. Nos últimos anos tem sido demonstrado que vários péptidos possuem propriedades anti-VIH-1, onde se incluem péptidos que derivam de proteínas do VIH e péptidos antimicrobianos (AMPs). Os AMPs fazem parte da imunidade inata de diversos organismos multicelulares e possuem um largo espetro de ação contra bactérias, fungos e vírus. As defensinas e as catelicidinas são as principais famílias de AMPs com ação conhecida contra o VIH-1. Adicionalmente, são vários os péptidos derivados de proteínas do VIH-1 que possuem atividade antiviral. De entre estes o que mais se destaca é o T20 por ser o único membro da classe dos inibidores de fusão aprovado para uso clínico. Este péptido deriva da glicoproteína do envelope gp41 e é um exemplo de sucesso no desenvolvimento de péptidos antivirais. Os AMPs de origem natural são normalmente encontrados em microorganismos, plantas e animais. No entanto, trabalhos de investigação recentes do nosso laboratório mostraram que sequências de péptidos com atividade antibacteriana podem também ser encontradas em proteínas virais, o que indica que estas proteínas são uma fonte inexplorada de péptidos bioativos. Assim, o trabalho aqui apresentado pretendeu explorar a hipótese de proteínas virais serem também uma fonte de novas sequências de péptidos antivirais (AVPs) e assim contribuir para o desenvolvimento de novos péptidos com atividade anti-HIV-1. A identificação de sequências de aminoácidos com potencial atividade antiviral foi realizada com recurso à ferramenta bioinformática AVPpred utilizando todas as proteínas estruturais de vírus anotadas na Uniprot. Tendo em conta todas as sequências com potencial atividade antiviral, obtidas de acordo com a classificação dos modelos de avaliação da ferramenta AVPpred, treze péptidos foram escolhidos para serem testados experimentalmente contra a estirpe laboratorial VIH-1NL4.3. De forma a entender a influência da carga de cada péptido na sua previsão enquanto AVP, foi necessário traçar um gráfico da carga dos péptidos positivos em função da sua previsão enquanto potencial péptido antiviral. Apesar de empiricamente ser visível uma correlação entre estas duas variáveis, estatisticamente esta não foi significativa. Assim, através desta análise entende-se que a carga dos péptidos antivirais não deverá ter uma influência direta na sua atividade antiviral. Através da realização de ensaios de infeção viral com células suscetíveis na presença de diferentes concentrações dos vários péptidos, foi possível determinar para cada péptido a concentração capaz de inibir cinquenta por cento (IC50) da infeção viral. Estes ensaios foram realizados com células cuja expressão de luciferase é regulada pela proteína viral trans-ativadora da transcrição (Tat). Esta proteína ao ligar-se ao promotor Long Terminal Repeat (LTR) inicia a sua transcrição e, permite a quantificação da infeção viral pela intensidade de luminescência observada, após a conversão de luciferina a oxi-luciferina que é catalisada enzimaticamente pelo luciferase. Através dos resultados obtidos foi possível observar que seis péptidos revelaram uma baixa atividade com um IC50 superior a 100 μM; cinco péptidos apresentaram atividade moderada com um IC50 entre os 12.5 μM e os 100 μM; e os péptidos vAVP 1472 e vAVP 1137 revelaram uma elevada atividade antiviral com um IC50 de 61.6 nM e de 5.63 μM, respetivamente. As curvas de dose-resposta obtidas na determinação da atividade antiviral dos dois péptidos com elevada atividade foram distintas sendo que, para a concentração mais elevada de péptido testada, o vAVP 1472 inibiu na totalidade a infeção viral, enquanto o vAVP 1137 só foi capaz de inibir 80% da infeção viral. Esta diferença pode ser explicada de forma empírica pelo passo do ciclo replicativo do vírus em que os péptidos atuam. O péptido vAVP 1472 ao inibir a infeção nos primeiros passos do ciclo replicativo, antes da integração do genoma viral, não permite a expressão de Tat, pelo que, não é possível haver produção de luciferase, o que se traduz num sinal praticamente nulo. Por outro lado, o péptido vAVP 1137 ao inibir a infeção após o passo de integração do genoma viral, possibilita que haja uma produção residual de luciferase, mesmo estando o péptido a inibir a infeção eficazmente. Comparando os resultados bioinformáticos com os resultados obtidos através dos ensaios antivirais foi possível observar algumas disparidades. Enquanto que a previsão obtida pela ferramenta AVPpred dava os treze péptidos com antivirais, nos resultados dos ensaios in vitro para três dos péptidos testados o seu valor de IC50 foi indeterminado. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram identificar dois péptidos derivados de proteínas virais com elevada atividade anti-VIH-1: o péptido vAVP 1472, que provém da proteína da cápside do vírus da Dengue tipo 3, e o péptido vAVP 1137, que provém da proteína da cápside do Coronavírus humano. Atualmente existem duas bases de dados de péptidos antivirais, a HIPdb e a AVPdb, que contêm todas as sequências peptídicas conhecidas de diferentes origens, cuja atividade foi descrita contra o VIH-1, ou outros vírus, respetivamente. Através da análise da informação disponível nestas bases de dados foi possível constatar que a maioria dos péptidos de origem viral é ativo, ou a sua atividade apenas foi descrita contra o vírus de origem. De fato os resultados obtidos para o péptido vAVP 3400 estão de acordo com este princípio. Este péptido que tinha sido descrito previamente como tendo elevada atividade antiviral contra o seu vírus de origem, o vírus sincicial respiratório, VSR, demonstrou apenas atividade moderada contra o VIH-1. No entanto os resultados obtidos com os péptidos que demonstraram elevada atividade anti-VIH-1, o vAVP 1472 e o vAVP 1137, mostram que é possível encontrar péptidos com elevada atividade contra vírus diferentes do vírus que contém as proteínas de onde estes péptidos são derivados. Com base nos resultados obtidos podemos concluir que as proteínas virais têm de fato potencial para serem usadas como fonte de péptidos bioativos, com destaque para a identificação de dois péptidos com elevada atividade anti-VIH-1.
Autores principais:	Silva, Nuno Rebello de Andrade Bustorff
Assunto:	VIH-1 Péptidos antivirais (AVPs) AVPpred Concentração capaz de inibir cinquenta por cento da infeção (IC50)
Ano:	2016
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	As patologias causadas por infeções contribuem consideravelmente para o número total de mortes que ocorrem mundialmente. Segundo a organização mundial de saúde, o vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1 (VIH-1) é responsável por cerca de 2.7% destas infeções. O VIH-1 foi identificado em 1981 e pertence, de acordo com a classificação de Baltimore, ao grupo dos vírus de cadeia simples de RNA com DNA intermediário (ssRNA-RT), fazendo parte da família Retroviridae e género Lentivirus. Este retrovírus é o responsável pela síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) e a sua infeção é caracterizada por causar uma rápida depleção na população de linfócitos T CD4+ do hospedeiro, tornando-o imunocomprometido e vulnerável a infeções oportunistas. Apesar dos esforços da comunidade científica ao longo dos anos, ainda não existe uma vacina ou tratamento totalmente eficaz. Atualmente os tratamentos disponíveis incluem vários medicamentos aprovados para uso clínico e aumentaram significativamente a esperança de vida dos pacientes infetados. O tratamento anti-retroviral (TARV) consiste num regime triplo de fármacos dirigidos a, pelo menos, dois alvos moleculares distintos e hoje em dia, é aceite como a forma mais eficaz de controlar a virémia. No entanto, o potencial deste tipo de terapia é limitado pelo desenvolvimento da resistência do VIH-1 aos fármacos. Assim, o estudo continuado de novos medicamentos eficazes é fundamental para combater estirpes que se tornam resistentes. O desenvolvimento de novos medicamentos peptídicos tem vindo a aumentar nos últimos anos. Os péptidos, tipicamente constituídos por sequências de 2 a 50 resíduos de aminoácidos, podem ser encontrados naturalmente em diferentes organismos onde desempenham várias funções nomeadamente como parte integrante do sistema imunitário. Nos últimos anos tem sido demonstrado que vários péptidos possuem propriedades anti-VIH-1, onde se incluem péptidos que derivam de proteínas do VIH e péptidos antimicrobianos (AMPs). Os AMPs fazem parte da imunidade inata de diversos organismos multicelulares e possuem um largo espetro de ação contra bactérias, fungos e vírus. As defensinas e as catelicidinas são as principais famílias de AMPs com ação conhecida contra o VIH-1. Adicionalmente, são vários os péptidos derivados de proteínas do VIH-1 que possuem atividade antiviral. De entre estes o que mais se destaca é o T20 por ser o único membro da classe dos inibidores de fusão aprovado para uso clínico. Este péptido deriva da glicoproteína do envelope gp41 e é um exemplo de sucesso no desenvolvimento de péptidos antivirais. Os AMPs de origem natural são normalmente encontrados em microorganismos, plantas e animais. No entanto, trabalhos de investigação recentes do nosso laboratório mostraram que sequências de péptidos com atividade antibacteriana podem também ser encontradas em proteínas virais, o que indica que estas proteínas são uma fonte inexplorada de péptidos bioativos. Assim, o trabalho aqui apresentado pretendeu explorar a hipótese de proteínas virais serem também uma fonte de novas sequências de péptidos antivirais (AVPs) e assim contribuir para o desenvolvimento de novos péptidos com atividade anti-HIV-1. A identificação de sequências de aminoácidos com potencial atividade antiviral foi realizada com recurso à ferramenta bioinformática AVPpred utilizando todas as proteínas estruturais de vírus anotadas na Uniprot. Tendo em conta todas as sequências com potencial atividade antiviral, obtidas de acordo com a classificação dos modelos de avaliação da ferramenta AVPpred, treze péptidos foram escolhidos para serem testados experimentalmente contra a estirpe laboratorial VIH-1NL4.3. De forma a entender a influência da carga de cada péptido na sua previsão enquanto AVP, foi necessário traçar um gráfico da carga dos péptidos positivos em função da sua previsão enquanto potencial péptido antiviral. Apesar de empiricamente ser visível uma correlação entre estas duas variáveis, estatisticamente esta não foi significativa. Assim, através desta análise entende-se que a carga dos péptidos antivirais não deverá ter uma influência direta na sua atividade antiviral. Através da realização de ensaios de infeção viral com células suscetíveis na presença de diferentes concentrações dos vários péptidos, foi possível determinar para cada péptido a concentração capaz de inibir cinquenta por cento (IC50) da infeção viral. Estes ensaios foram realizados com células cuja expressão de luciferase é regulada pela proteína viral trans-ativadora da transcrição (Tat). Esta proteína ao ligar-se ao promotor Long Terminal Repeat (LTR) inicia a sua transcrição e, permite a quantificação da infeção viral pela intensidade de luminescência observada, após a conversão de luciferina a oxi-luciferina que é catalisada enzimaticamente pelo luciferase. Através dos resultados obtidos foi possível observar que seis péptidos revelaram uma baixa atividade com um IC50 superior a 100 μM; cinco péptidos apresentaram atividade moderada com um IC50 entre os 12.5 μM e os 100 μM; e os péptidos vAVP 1472 e vAVP 1137 revelaram uma elevada atividade antiviral com um IC50 de 61.6 nM e de 5.63 μM, respetivamente. As curvas de dose-resposta obtidas na determinação da atividade antiviral dos dois péptidos com elevada atividade foram distintas sendo que, para a concentração mais elevada de péptido testada, o vAVP 1472 inibiu na totalidade a infeção viral, enquanto o vAVP 1137 só foi capaz de inibir 80% da infeção viral. Esta diferença pode ser explicada de forma empírica pelo passo do ciclo replicativo do vírus em que os péptidos atuam. O péptido vAVP 1472 ao inibir a infeção nos primeiros passos do ciclo replicativo, antes da integração do genoma viral, não permite a expressão de Tat, pelo que, não é possível haver produção de luciferase, o que se traduz num sinal praticamente nulo. Por outro lado, o péptido vAVP 1137 ao inibir a infeção após o passo de integração do genoma viral, possibilita que haja uma produção residual de luciferase, mesmo estando o péptido a inibir a infeção eficazmente. Comparando os resultados bioinformáticos com os resultados obtidos através dos ensaios antivirais foi possível observar algumas disparidades. Enquanto que a previsão obtida pela ferramenta AVPpred dava os treze péptidos com antivirais, nos resultados dos ensaios in vitro para três dos péptidos testados o seu valor de IC50 foi indeterminado. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram identificar dois péptidos derivados de proteínas virais com elevada atividade anti-VIH-1: o péptido vAVP 1472, que provém da proteína da cápside do vírus da Dengue tipo 3, e o péptido vAVP 1137, que provém da proteína da cápside do Coronavírus humano. Atualmente existem duas bases de dados de péptidos antivirais, a HIPdb e a AVPdb, que contêm todas as sequências peptídicas conhecidas de diferentes origens, cuja atividade foi descrita contra o VIH-1, ou outros vírus, respetivamente. Através da análise da informação disponível nestas bases de dados foi possível constatar que a maioria dos péptidos de origem viral é ativo, ou a sua atividade apenas foi descrita contra o vírus de origem. De fato os resultados obtidos para o péptido vAVP 3400 estão de acordo com este princípio. Este péptido que tinha sido descrito previamente como tendo elevada atividade antiviral contra o seu vírus de origem, o vírus sincicial respiratório, VSR, demonstrou apenas atividade moderada contra o VIH-1. No entanto os resultados obtidos com os péptidos que demonstraram elevada atividade anti-VIH-1, o vAVP 1472 e o vAVP 1137, mostram que é possível encontrar péptidos com elevada atividade contra vírus diferentes do vírus que contém as proteínas de onde estes péptidos são derivados. Com base nos resultados obtidos podemos concluir que as proteínas virais têm de fato potencial para serem usadas como fonte de péptidos bioativos, com destaque para a identificação de dois péptidos com elevada atividade anti-VIH-1.