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Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Angola: molecular determinants of resistance and integration in a global epidemiological scenario

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose, tem evoluído com o seu hospedeiro principal, o ser humano, ao longo de milhares de anos, apresentando inclusivamente características que permitem uma demarcação regional e linhagens próprias. A tuberculose é definida pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma das dez principais causas de morte a nível mundial, com particular peso em países emergentes e sub-desenvolvidos, onde o panorama socio-económico se reflecte em padrões de saúde pública aquém dos padrões encontrados em países ocidentais industrializados. Acresce a este panorama a dificuldade na obtenção de antibióticos em quantidades suficientes, resultando em regimes de tratamento incompletos, auxiliando a pressão selectiva que origina a propagação de estirpes resistentes aos fármacos antibióticos, reconhecidas pela OMS como um problema crescente nos esforços de erradicação da tuberculose. Estes padrões de resistência são definidos num número de patamares: estirpes multi-resistentes são definidas como estirpes apresentando resistência à rifampicina e isoniazida; estirpes pré-extensivamente resistentes apresentam um padrão multi-resistente, com resistência adicional a fluoroquinolonas; estirpes extensivamente resistentes são definidas como as de padrão semelhante às pré-extensivamente resistentes, desta feita com resistência adicional seja ao linezolide ou bedaquilina. M. tuberculosis é uma bactéria com um ciclo de crescimento e propagação complexo que exige parâmetros específicos para crescimento, bem como instalações e pessoal especializado, nomeadamente compatíveis com o padrão de biosegurança de nível 3. Estas exigências, emparelhadas com a taxa de crescimento relativamente lenta de M. tuberculosis, levam a que a avaliação de resistência a antibióticos sejam especialmente demorados. Por outro lado, o genoma relativamente estável de M. tuberculosis, estimado com uma taxa de mutação de 0.3 a 0.5 SNPs por genoma por ano, combinado com uma transmissão de mutações quase exclusivamente vertical, ou seja, de progenitor para progenia, permite uma caracterização genética eficaz de M. tuberculosis que, juntamente com princípios genéticos de obtenção de resistência, propicia a criação de modelos de previsão de padrões de resistência a antibióticos, ou seja, resistência genotípica, sem necessidade de instalações e pessoal com o nível de especialização exigido na testagem tradicional de padrões de resistência, dita testagem fenotípica. Adicionalmente, esta constelação de factores torna favorável a análise filogenética de M. tuberculosis, direccionada à monitorização de estirpes e seguimento de surtos. Actualmente, graças a avanços na área de sequenciação genética, permitindo a sequenciação de genomas de forma relativamente rápida e de baixo custo, juntamente com avanços na compreensão das bases genéticas da resistência a antibióticos por parte de M. tuberculosis, culminando na criação de bibliotecas de mutações causadoras de resitências, a abordagem genotípica tornou-se um modelo de análise de padrões de resistência em alguns países onde a tuberculose não é uma doença de marcada frequência, como o Reino Unido e a Holanda. No contexto da Comunidade de Países de Língua Portuguesa, Angola, Brasil, Guiné-Bissau e Moçambique são considerados pela Organização Mundial de Saúde como países de high burden (lit. peso elevado) de tuberculose. Notável também Timor-Lorosae devido à sua proximidade geográfica com a Indonésia, outro país do mesmo agrupamento. Com Portugal servindo de intermediário entre estes países e o resto da Europa, torna-se pertinente caracterizar o contexto em que M. tuberculosis se insere nestes países. Como tal, é importante obter amostras de doentes com tuberculose nestes países, isolar o agente causativo e sequenciar o seu genoma de forma a obter informação relativa a padrões de resistência antibiótica e contexto filogenético. O trabalho desenvolvido neste estudo-piloto envolve o uso de 17 isolados obtidos no Hospital da Divina Providência, na zona de Kilamba-Kiaxi, em Luanda, Angola, entre Março e Junho de 2014, de acordo com os padrões definidos pela comissão de ética do ministério da Saúde Angolano e com consentimento informado dos doentes de quem estas amostras foram obtidas. Estes 17 isolados foram devidamente sequenciados, servindo a estirpe H37Rv como referência para o mapeamento efectuado. As sequenciações assim obtidas foram de seguida avaliadas em relação aos seus possíveis padrões de resistência através de software especializado, nomeadamente TB-Profiler, Phyres e Mykrobe, sendo os resultados obtidos comparados entre si e com resultados obtidos por testagem fenotípica, realizada de acordo com o método de referência definido pelo Comité Europeu sobre Testagem de Susceptibilidade Antimicrobiana (lit. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST), de concentração mínima inibitória, para isoniazida, rifampicina, etambutol, estreptomicina, amicacina e ofloxacina, sendo que se verificaram um número de discrepâncias, nomeadamente os software testados não conseguiram prever a resistência de algumas estirpes à isoniazida, ou preveram resistências que não se verificaram em contexto fenotípico, salientando a desvantagem dos métodos genotípicos, nomeadamente o facto de dependerem de catálogos em constante actualização de mutações causadoras de resistências, cuja validade depende de despistagem por métodos fenotípicos ou de descoberta em contexto clínico. Foi igualmente realizada uma análise filogenética das 17 estirpes em três contextos diferentes: entre si, em junção com estirpes isoladas em Portugal e, finalmente, das 17 estirpes estudadas, 13 delas, pertencentes à sub-linhagem 4.3, foram usadas em comparação com 1682 estirpes isoladas em múltiplos países, em contexto mundial, fornecidas pelo European Nucleotide Archive (ENA, lit. Arquivo Nucleotídico Europeu), também pertencentes à sub-linhagem 4.3. As estirpes foram agrupadas em árvores filogenéticas e comparadas para a formação de clusters através de distanciamento de SNPs, para distâncias de cinco, 12, 25, 50 e 100 SNPs, sendo que cadeias de transmissão directas são geralmente reconhecidas para distâncias de SNP entre cinco e 12 SNPs. Demonstrou-se que as estirpes isoladas não têm um relacionamento directo entre si. Quanto ao contexto a nível de Portugal, detectou-se clustering a distâncias de 50 SNP, indicativo de cadeias indirectas de transmissão. Igualmente, a nível mundial, cinco das estirpes estudadas agruparam em cluster, sendo que quatro delas (AO000110, AO000111, AO000113, AO000131) agruparam no mesmo cluster com 38 outras estirpes e outra das estirpes estudadas (AO000138) agrupou em cluster com três outras estirpes. As estirpes pertencentes a estes clusters são oriundas de Portugal, Brasil, Malawi, Canadá e do Reino Unido, indicando para uma possível ponte de ligação entre a Comunidade de Países de Língua Portuguesa e a anglosfera. Uma análise das árvores filogenéticas englobando as estirpes não agrupadas em cluster com estirpes na sua proximidade filogenética reforça esta ideia, com estas estirpes aparentando ter um ancestral comum com estirpes isoladas em Portugal, Austrália, Bangladesh, Brasil, Canadá, Malawi e o Reino Unido. Todas as estirpes englobadas nos estudos filogenéticos foram igualmente avaliadas face aos seus perfis de padrões de resistência a fármacos antibióticos. Uma vez que não existe informação acerca de padrões de resistência fenotípica para todas as estirpes, previsõoes de padrões de resistência com base em análise por TB-Profiler foram utilizados para esta análise. Num âmbito geral, apesar da existência nos clusters formados de uma série de estirpes com padrões de multi- e resistência pré-extensiva, a maioria das estirpes agrupadas em cluster apresentam padrões de susceptibilidade a fármacos antibióticos. No entanto, uma vez que a informação aqui avaliada foi obtida através de software preditivo, é possível que um número de estirpes apresente resistência fenotípica a um número de fármacos antibióticos. A realização deste trabalho envolveu ainda a criação de um número de scripts nas línguagens de programação bash e R, de forma a agilizar os processos envolvendo o software de apoio. Os resultados obtidos neste estudo apontam para a pertinência e necessidade de caracterização da tuberculose em Angola, assegurando uma melhor compreensão das cadeias de transmissão e contexto filogenético da tuberculose na região, por conseguinte contribuindo para melhor caracterização de cadeias de transmissão de M. tuberculosis noutras regiões do mundo.
Autores principais:	Nogueira, João Sebastião Santos
Assunto:	Mycobacterium tuberculosis Whole genome sequencing Phylogenetics Drug resistance screening Community of portuguese-speaking countries Teses de mestrado - 2022
Ano:	2022
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose, tem evoluído com o seu hospedeiro principal, o ser humano, ao longo de milhares de anos, apresentando inclusivamente características que permitem uma demarcação regional e linhagens próprias. A tuberculose é definida pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma das dez principais causas de morte a nível mundial, com particular peso em países emergentes e sub-desenvolvidos, onde o panorama socio-económico se reflecte em padrões de saúde pública aquém dos padrões encontrados em países ocidentais industrializados. Acresce a este panorama a dificuldade na obtenção de antibióticos em quantidades suficientes, resultando em regimes de tratamento incompletos, auxiliando a pressão selectiva que origina a propagação de estirpes resistentes aos fármacos antibióticos, reconhecidas pela OMS como um problema crescente nos esforços de erradicação da tuberculose. Estes padrões de resistência são definidos num número de patamares: estirpes multi-resistentes são definidas como estirpes apresentando resistência à rifampicina e isoniazida; estirpes pré-extensivamente resistentes apresentam um padrão multi-resistente, com resistência adicional a fluoroquinolonas; estirpes extensivamente resistentes são definidas como as de padrão semelhante às pré-extensivamente resistentes, desta feita com resistência adicional seja ao linezolide ou bedaquilina. M. tuberculosis é uma bactéria com um ciclo de crescimento e propagação complexo que exige parâmetros específicos para crescimento, bem como instalações e pessoal especializado, nomeadamente compatíveis com o padrão de biosegurança de nível 3. Estas exigências, emparelhadas com a taxa de crescimento relativamente lenta de M. tuberculosis, levam a que a avaliação de resistência a antibióticos sejam especialmente demorados. Por outro lado, o genoma relativamente estável de M. tuberculosis, estimado com uma taxa de mutação de 0.3 a 0.5 SNPs por genoma por ano, combinado com uma transmissão de mutações quase exclusivamente vertical, ou seja, de progenitor para progenia, permite uma caracterização genética eficaz de M. tuberculosis que, juntamente com princípios genéticos de obtenção de resistência, propicia a criação de modelos de previsão de padrões de resistência a antibióticos, ou seja, resistência genotípica, sem necessidade de instalações e pessoal com o nível de especialização exigido na testagem tradicional de padrões de resistência, dita testagem fenotípica. Adicionalmente, esta constelação de factores torna favorável a análise filogenética de M. tuberculosis, direccionada à monitorização de estirpes e seguimento de surtos. Actualmente, graças a avanços na área de sequenciação genética, permitindo a sequenciação de genomas de forma relativamente rápida e de baixo custo, juntamente com avanços na compreensão das bases genéticas da resistência a antibióticos por parte de M. tuberculosis, culminando na criação de bibliotecas de mutações causadoras de resitências, a abordagem genotípica tornou-se um modelo de análise de padrões de resistência em alguns países onde a tuberculose não é uma doença de marcada frequência, como o Reino Unido e a Holanda. No contexto da Comunidade de Países de Língua Portuguesa, Angola, Brasil, Guiné-Bissau e Moçambique são considerados pela Organização Mundial de Saúde como países de high burden (lit. peso elevado) de tuberculose. Notável também Timor-Lorosae devido à sua proximidade geográfica com a Indonésia, outro país do mesmo agrupamento. Com Portugal servindo de intermediário entre estes países e o resto da Europa, torna-se pertinente caracterizar o contexto em que M. tuberculosis se insere nestes países. Como tal, é importante obter amostras de doentes com tuberculose nestes países, isolar o agente causativo e sequenciar o seu genoma de forma a obter informação relativa a padrões de resistência antibiótica e contexto filogenético. O trabalho desenvolvido neste estudo-piloto envolve o uso de 17 isolados obtidos no Hospital da Divina Providência, na zona de Kilamba-Kiaxi, em Luanda, Angola, entre Março e Junho de 2014, de acordo com os padrões definidos pela comissão de ética do ministério da Saúde Angolano e com consentimento informado dos doentes de quem estas amostras foram obtidas. Estes 17 isolados foram devidamente sequenciados, servindo a estirpe H37Rv como referência para o mapeamento efectuado. As sequenciações assim obtidas foram de seguida avaliadas em relação aos seus possíveis padrões de resistência através de software especializado, nomeadamente TB-Profiler, Phyres e Mykrobe, sendo os resultados obtidos comparados entre si e com resultados obtidos por testagem fenotípica, realizada de acordo com o método de referência definido pelo Comité Europeu sobre Testagem de Susceptibilidade Antimicrobiana (lit. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST), de concentração mínima inibitória, para isoniazida, rifampicina, etambutol, estreptomicina, amicacina e ofloxacina, sendo que se verificaram um número de discrepâncias, nomeadamente os software testados não conseguiram prever a resistência de algumas estirpes à isoniazida, ou preveram resistências que não se verificaram em contexto fenotípico, salientando a desvantagem dos métodos genotípicos, nomeadamente o facto de dependerem de catálogos em constante actualização de mutações causadoras de resistências, cuja validade depende de despistagem por métodos fenotípicos ou de descoberta em contexto clínico. Foi igualmente realizada uma análise filogenética das 17 estirpes em três contextos diferentes: entre si, em junção com estirpes isoladas em Portugal e, finalmente, das 17 estirpes estudadas, 13 delas, pertencentes à sub-linhagem 4.3, foram usadas em comparação com 1682 estirpes isoladas em múltiplos países, em contexto mundial, fornecidas pelo European Nucleotide Archive (ENA, lit. Arquivo Nucleotídico Europeu), também pertencentes à sub-linhagem 4.3. As estirpes foram agrupadas em árvores filogenéticas e comparadas para a formação de clusters através de distanciamento de SNPs, para distâncias de cinco, 12, 25, 50 e 100 SNPs, sendo que cadeias de transmissão directas são geralmente reconhecidas para distâncias de SNP entre cinco e 12 SNPs. Demonstrou-se que as estirpes isoladas não têm um relacionamento directo entre si. Quanto ao contexto a nível de Portugal, detectou-se clustering a distâncias de 50 SNP, indicativo de cadeias indirectas de transmissão. Igualmente, a nível mundial, cinco das estirpes estudadas agruparam em cluster, sendo que quatro delas (AO000110, AO000111, AO000113, AO000131) agruparam no mesmo cluster com 38 outras estirpes e outra das estirpes estudadas (AO000138) agrupou em cluster com três outras estirpes. As estirpes pertencentes a estes clusters são oriundas de Portugal, Brasil, Malawi, Canadá e do Reino Unido, indicando para uma possível ponte de ligação entre a Comunidade de Países de Língua Portuguesa e a anglosfera. Uma análise das árvores filogenéticas englobando as estirpes não agrupadas em cluster com estirpes na sua proximidade filogenética reforça esta ideia, com estas estirpes aparentando ter um ancestral comum com estirpes isoladas em Portugal, Austrália, Bangladesh, Brasil, Canadá, Malawi e o Reino Unido. Todas as estirpes englobadas nos estudos filogenéticos foram igualmente avaliadas face aos seus perfis de padrões de resistência a fármacos antibióticos. Uma vez que não existe informação acerca de padrões de resistência fenotípica para todas as estirpes, previsõoes de padrões de resistência com base em análise por TB-Profiler foram utilizados para esta análise. Num âmbito geral, apesar da existência nos clusters formados de uma série de estirpes com padrões de multi- e resistência pré-extensiva, a maioria das estirpes agrupadas em cluster apresentam padrões de susceptibilidade a fármacos antibióticos. No entanto, uma vez que a informação aqui avaliada foi obtida através de software preditivo, é possível que um número de estirpes apresente resistência fenotípica a um número de fármacos antibióticos. A realização deste trabalho envolveu ainda a criação de um número de scripts nas línguagens de programação bash e R, de forma a agilizar os processos envolvendo o software de apoio. Os resultados obtidos neste estudo apontam para a pertinência e necessidade de caracterização da tuberculose em Angola, assegurando uma melhor compreensão das cadeias de transmissão e contexto filogenético da tuberculose na região, por conseguinte contribuindo para melhor caracterização de cadeias de transmissão de M. tuberculosis noutras regiões do mundo.