Publicação
Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
| Resumo: | A fenilcetonúria (PKU) é a doença genética rara que afeta com maior prevalência o metabolismo de aminoácidos. Esta doença é causada por mutações que afetam o gene PAH que codifica para a enzima fenilalanina hidroxilase humana (hPAH), expressa maioritariamente nos hepatócitos. Esta proteína é responsável pela conversão de fenilalanina (L-Phe) em tirosina (L-Tyr) na presença do cofator tetrahidrobiopterina (BH4), oxigénio molecular e de Fe(II) não hemíco presente no centro ativo. Atualmente, continua a haver urgência no desenvolvimento de novas terapias para a PKU, sendo que as frequentemente utilizadas envolvem uma restrição alimentar (terapia dietética) e a suplementação com o cofator BH4. A hPAH é um homotetrâmero em que cada subunidade (≈ 50 kDa) apresenta um domínio regulador N-terminal, um domínio catalítico e um domínio de oligomerização C-terminal responsável pela dimerização e consequente tetramerização. Uma terapia de reposição enzimática (ERT) envolvendo a administração de hPAH é presentemente um desafio devido em parte à instabilidade da proteína (elevada sensibilidade às condições do meio), à elevada massa molecular (≈200 kDa), necessidade da presença de tetrâmeros e do cofactoe enzimático exercer a sua função no ambiente biológico. Uma solução atrativa para ultrapassar estes constrangimentos envolve a formulação da proteína mantendo a sua estabilidade e funcionalidade e de um bom sistema de distribuição biofarmacológica, como os enzimossomas. Neste trabalho são apresentados os resultados obtidos na otimização das condições de modificação da hPAH para futuramente ligar covalentemente a enzima a lipossomas vazios produzindo enzimossomas. A hPAH recombinante foi expressa em E. coli e purificada através do recurso a uma cromatografia de afinidade com iões imobilizados. As espécies tetraméricas, posteriormente isoladas por cromatografia de exclusão molecular, foram modificadas usando diferentes razões de agente modificador:hPAH (8:1; 16:1 e 24:1), sendo utilizado como agente modificador o N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA). A hPAH modificada foi isolada e caracterizada em termos de rendimento de proteína recuperada, grau de modificação, atividade enzimática com pré-ativação por L-Phe, termoestabilidade e conformação quaternária. Através da comparação dos resultados obtidos com os da hPAH não-modificada, mas sujeita às mesmas condições reacionais da proteína modificada, observou-se alterações mínimas na atividade enzimática e um ligeiro aumento na termoestabilidade (parâmetro Tm) da proteína modificada. Estes dados indicam que a hPAH modificada preserva a sua função catalítica e estabilidade. Este trabalho permitiu assim estabelecer as condições experimentais para no futuro ligar covalentemente a proteína modificada a lipossomas vazios formando enzimosomas. |
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| Autores principais: | Dias, Adriana dos Santos |
| Assunto: | Human phenylalanine hydroxylase Phenylketonuria Enzyme reposition therapy Enzymosomes Protein acetylthyolation Teses de mestrado -2021 |
| Ano: | 2021 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | A fenilcetonúria (PKU) é a doença genética rara que afeta com maior prevalência o metabolismo de aminoácidos. Esta doença é causada por mutações que afetam o gene PAH que codifica para a enzima fenilalanina hidroxilase humana (hPAH), expressa maioritariamente nos hepatócitos. Esta proteína é responsável pela conversão de fenilalanina (L-Phe) em tirosina (L-Tyr) na presença do cofator tetrahidrobiopterina (BH4), oxigénio molecular e de Fe(II) não hemíco presente no centro ativo. Atualmente, continua a haver urgência no desenvolvimento de novas terapias para a PKU, sendo que as frequentemente utilizadas envolvem uma restrição alimentar (terapia dietética) e a suplementação com o cofator BH4. A hPAH é um homotetrâmero em que cada subunidade (≈ 50 kDa) apresenta um domínio regulador N-terminal, um domínio catalítico e um domínio de oligomerização C-terminal responsável pela dimerização e consequente tetramerização. Uma terapia de reposição enzimática (ERT) envolvendo a administração de hPAH é presentemente um desafio devido em parte à instabilidade da proteína (elevada sensibilidade às condições do meio), à elevada massa molecular (≈200 kDa), necessidade da presença de tetrâmeros e do cofactoe enzimático exercer a sua função no ambiente biológico. Uma solução atrativa para ultrapassar estes constrangimentos envolve a formulação da proteína mantendo a sua estabilidade e funcionalidade e de um bom sistema de distribuição biofarmacológica, como os enzimossomas. Neste trabalho são apresentados os resultados obtidos na otimização das condições de modificação da hPAH para futuramente ligar covalentemente a enzima a lipossomas vazios produzindo enzimossomas. A hPAH recombinante foi expressa em E. coli e purificada através do recurso a uma cromatografia de afinidade com iões imobilizados. As espécies tetraméricas, posteriormente isoladas por cromatografia de exclusão molecular, foram modificadas usando diferentes razões de agente modificador:hPAH (8:1; 16:1 e 24:1), sendo utilizado como agente modificador o N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA). A hPAH modificada foi isolada e caracterizada em termos de rendimento de proteína recuperada, grau de modificação, atividade enzimática com pré-ativação por L-Phe, termoestabilidade e conformação quaternária. Através da comparação dos resultados obtidos com os da hPAH não-modificada, mas sujeita às mesmas condições reacionais da proteína modificada, observou-se alterações mínimas na atividade enzimática e um ligeiro aumento na termoestabilidade (parâmetro Tm) da proteína modificada. Estes dados indicam que a hPAH modificada preserva a sua função catalítica e estabilidade. Este trabalho permitiu assim estabelecer as condições experimentais para no futuro ligar covalentemente a proteína modificada a lipossomas vazios formando enzimosomas. |
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