Publicação

Histone deacetylase inhibitors as therapeutic candidates against IL-7-responsive acute lymphoblastic leukemia

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o tipo de cancro mais frequente em crianças, sendo caracterizado pela expansão descontrolada de células linfóides não diferenciadas, podendo estas pertencer à linhagem de células B ou de células T. Apesar da opção terapêutica atual, constituída por ciclos de quimioterapia, atingir uma eficácia em que 90% dos doentes sobrevivem, esta sobrevivência é drasticamente reduzida em doentes com idade superior a 50 anos. Além disso, os pacientes que sobrevivem sofrem muitas vezes de efeitos secundários adversos da terapia ou até de uma recidiva mais resistente da doença, realçando, deste modo, a necessidade de encontrar alternativas terapêuticas mais eficazes, direcionadas, e com menos efeitos adversos. As células das linhagens B e T precisam de fatores externos para sobreviver, diferenciar e proliferar nos seus diferentes microambientes. Um destes fatores é a interleucina-7 (IL-7), cuja presença é essencial para a sobrevivência e maturação dos precursores linfóides. O eixo de sinalização da IL-7 depende do seu recetor na superfície das células B e T, o recetor da IL-7 (IL-7R). Este é constituído por duas subunidades, a subunidade α (IL-7Rα/IL7R) e a cadeia γ comum (ɣc/IL2RG), partilhada pelos recetores da IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. A ligação da IL-7 ao seu recetor desencadeia sinalização através de três vias principais: JAK/STAT, PI3K/Akt/mTOR e MEK/Erk, que convergem nos seus principais efeitos, sendo estes a promoção da expressão de genes associados a proliferação, sobrevivência e diferenciação. Todas estas vias de sinalização estão implicadas em LLA, estando normalmente desreguladas neste contexto, o que promove a progressão da leucemia. A IL-7 e o seu recetor estão também envolvidos no desenvolvimento de leucemia, através da ativação das vias de sinalização mencionadas. Diferentes estudos demonstraram que estimulação com IL-7 promove a proliferação e a sobrevivência de células leucémicas tanto in vitro como in vivo. Adicionalmente, existem doentes que possuem mutações no recetor da IL-7 que promovem a homodimerização aberrante de duas subunidades α, facilitando uma ativação anormal e constitutiva da sinalização, mesmo na ausência de IL-7. Assim, existe atualmente um esforço para melhorar o arsenal terapêutico contra a leucemia, sendo o eixo de sinalização mediado por IL-7 um alvo atrativo para o desenvolvimento de fármacos mais específicos contra as células leucémicas. O nosso laboratório realizou um ensaio com um painel constituído por múltiplos compostos químicos com o objetivo de encontrar novas classes de inibidores com atividade anti-tumoral em células dependentes de IL-7. Este painel revelou que inibidores de desacetilases de histonas (HDACs) são capazes de inibir, de uma forma previamente desconhecida, os efeitos da estimulação por IL-7. As HDACs são enzimas responsáveis por desacetilar uma grande variedade de substratos, incluindo não só histonas, mas também outras proteínas como fatores de transcrição (p53, STAT5, etc.), entre outros. Alterações do estado de acetilação de certas proteínas podem alterar a sua atividade, podendo assim existir um efeito terapêutico no tratamento com inibidores de HDACs. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar de que forma as HDACs interagem com as vias de sinalização associadas a IL-7 e avaliar, numa fase inicial, o potencial terapêutico do tratamento de células sensíveis à IL-7 com inibidores de HDACs. Começámos por avaliar de que modo um inibidor de HDACs, denominado SAHA ou vorinostat, afeta os efeitos positivos que a estimulação com IL-7 tem na viabilidade de duas linhas celulares dependentes de IL-7, D1, uma linha derivada de timócitos murinos dependente de IL-7, e Ba/F3 transduzidas de forma estável com o recetor wild type (WT) da IL-7 (Ba/F3 WT). Observámos que o tratamento com SAHA foi capaz de reduzir o aumento de viabilidade resultante de sinalização por IL-7, consoante a concentração do inibidor. O tratamento com SAHA foi também capaz de inibir o aumento de viabilidade celular promovido pela IL-7 em diferentes tipos de amostras primárias sensíveis à IL-7. Descobrimos ainda pela primeira vez dois mecanismos complementares pelos quais inibição de HDACs afeta o eixo de sinalização da IL-7. O primeiro mecanismo envolve a redução da expressão de IL7R. Diferentes amostras primárias sensíveis à IL-7 e a linha celular TAIL7 (derivada de células humanas de LLA de origem T dependentes de IL-7) tratadas com SAHA apresentam uma menor expressão génica de IL7R, com consequente redução da presença do recetor à superfície das células e da ativação das vias de sinalização por ele mediadas. Trabalhos anteriores demonstraram que um dos fatores de transcrição importantes para a regulação da sinalização de IL-7, denominado FoxO1, pode ser acetilado, sendo a sua acetilação capaz de diminuir a sua atividade transcricional e promover a sua fosforilação inativante. Uma vez que a expressão génica do recetor da IL-7 é regulada positivamente pelo fator FoxO1, testámos se a inibição de HDACs afeta a fosforilação de FoxO1 como possível consequência do aumento de acetilação na linha celular D1. Confirmámos que o tratamento com SAHA aumenta a fosforilação de FoxO1 além da fosforilação basal induzida pela estimulação com IL-7, solidificando a hipótese de que este fator de transcrição é afetado por HDACs, e que a sua acetilação facilita a sua fosforilação, reduzindo assim a expressão génica de IL7R. Contudo, o mecanismo associado à fosforilação de FoxO1 não pode ser o único mecanismo de ação dependente de IL-7 do SAHA, uma vez que as Ba/F3 WT também são afetadas pelo tratamento com este inibidor. Estas células não expressam o IL-7R murino, apresentando apenas uma expressão estável e constitutiva do recetor da IL-7 humano WT, derivado de transdução, sob regulação de um promotor viral independente de FoxO1 ativo. Assim, alterações no estado de acetilação de FoxO1 não justificam os efeitos observados em Ba/F3 WT, pelo que deve existir outro mecanismo pelo qual HDACis afetam as vias de ativação de IL-7. Com o objetivo de explorar esta hipótese, estas células foram tratadas com SAHA e avaliámos os seus efeitos na sinalização mediada por IL-7. Curiosamente, nenhum efeito foi observado em elementos necessários em fases mais iniciais da sinalização. Contudo, conseguimos observar uma redução nos níveis de ativação de alguns elementos mais tardios na cadeia de sinalização, nomeadamente na cinase S6K e na proteína ribossomal S6, dois elementos da via PI3K/Akt/mTOR. Em resposta ao tratamento com SAHA verificámos uma redução da fosforilação destes dois elementos, mesmo na presença de IL-7, indicando que este inibidor pode interferir no grau de ativação de alguns elementos das cadeias de sinalização, reduzindo assim os efeitos da IL-7 essenciais para a sobrevivência destas células. Uma vez que os nossos estudos sugerem que a IL-7 é capaz de ativar HDACs, resolvemos determinar qual de entre as vias de sinalização ativadas por IL-7 é a via responsável pela ativação de HDACs. A ativação de JAK1 promovida pela estimulação com IL-7 parece ser essencial para a atividade das HDACs, visto que na sua ausência, após tratamento com o inibidor de JAK1/2 ruxolitinib, não se observou a esperada redução do nível de acetilação de histonas resultante da atividade de HDACs induzida pela estimulação com IL-7. Várias questões continuam ainda sem resposta, tais como, quais as HDACs ativadas pela estimulação com IL-7, e se outros fatores de transcrição importantes para a expressão do IL-7R são afetados pelo tratamento com inibidores de HDACs. Apesar da necessidade de estudos futuros, este trabalho fornece fundamentos para testar o efeito da inibição de HDACs no tratamento de ALL in vivo usando modelos animais. Apesar das questões que ficaram em aberto, conseguimos clarificar quais as principais consequências funcionais que o tratamento com inibidores de HDAC têm em células dependentes de IL-7, quer a nível da redução da expressão génica de IL7R, quer a nível da inativação das vias de sinalização por ele mediadas. Conseguimos ainda identificar JAK1 como um elemento de sinalização essencial para a ativação de HDACs dependente de IL-7. Este trabalho permitiu solidificar as bases para o estudo de HDACis para o tratamento de ALL sensível à IL-7, realçando o seu valor terapêutico. Em última análise, os resultados aqui apresentados revelam o importante elo entre IL-7 e HDACs, e consequentemente uma ligação previamente pouco reconhecida entre a sinalização de IL-7 e modificações epigenéticas.
Autores principais:	Fontela, João Paulo Rita
Assunto:	Leucemia linfoblástica aguda Interleucina-7 Recetor da interleucina-7 Desacetilases de histonas Terapia direcionada Teses de mestrado - 2022
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o tipo de cancro mais frequente em crianças, sendo caracterizado pela expansão descontrolada de células linfóides não diferenciadas, podendo estas pertencer à linhagem de células B ou de células T. Apesar da opção terapêutica atual, constituída por ciclos de quimioterapia, atingir uma eficácia em que 90% dos doentes sobrevivem, esta sobrevivência é drasticamente reduzida em doentes com idade superior a 50 anos. Além disso, os pacientes que sobrevivem sofrem muitas vezes de efeitos secundários adversos da terapia ou até de uma recidiva mais resistente da doença, realçando, deste modo, a necessidade de encontrar alternativas terapêuticas mais eficazes, direcionadas, e com menos efeitos adversos. As células das linhagens B e T precisam de fatores externos para sobreviver, diferenciar e proliferar nos seus diferentes microambientes. Um destes fatores é a interleucina-7 (IL-7), cuja presença é essencial para a sobrevivência e maturação dos precursores linfóides. O eixo de sinalização da IL-7 depende do seu recetor na superfície das células B e T, o recetor da IL-7 (IL-7R). Este é constituído por duas subunidades, a subunidade α (IL-7Rα/IL7R) e a cadeia γ comum (ɣc/IL2RG), partilhada pelos recetores da IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. A ligação da IL-7 ao seu recetor desencadeia sinalização através de três vias principais: JAK/STAT, PI3K/Akt/mTOR e MEK/Erk, que convergem nos seus principais efeitos, sendo estes a promoção da expressão de genes associados a proliferação, sobrevivência e diferenciação. Todas estas vias de sinalização estão implicadas em LLA, estando normalmente desreguladas neste contexto, o que promove a progressão da leucemia. A IL-7 e o seu recetor estão também envolvidos no desenvolvimento de leucemia, através da ativação das vias de sinalização mencionadas. Diferentes estudos demonstraram que estimulação com IL-7 promove a proliferação e a sobrevivência de células leucémicas tanto in vitro como in vivo. Adicionalmente, existem doentes que possuem mutações no recetor da IL-7 que promovem a homodimerização aberrante de duas subunidades α, facilitando uma ativação anormal e constitutiva da sinalização, mesmo na ausência de IL-7. Assim, existe atualmente um esforço para melhorar o arsenal terapêutico contra a leucemia, sendo o eixo de sinalização mediado por IL-7 um alvo atrativo para o desenvolvimento de fármacos mais específicos contra as células leucémicas. O nosso laboratório realizou um ensaio com um painel constituído por múltiplos compostos químicos com o objetivo de encontrar novas classes de inibidores com atividade anti-tumoral em células dependentes de IL-7. Este painel revelou que inibidores de desacetilases de histonas (HDACs) são capazes de inibir, de uma forma previamente desconhecida, os efeitos da estimulação por IL-7. As HDACs são enzimas responsáveis por desacetilar uma grande variedade de substratos, incluindo não só histonas, mas também outras proteínas como fatores de transcrição (p53, STAT5, etc.), entre outros. Alterações do estado de acetilação de certas proteínas podem alterar a sua atividade, podendo assim existir um efeito terapêutico no tratamento com inibidores de HDACs. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar de que forma as HDACs interagem com as vias de sinalização associadas a IL-7 e avaliar, numa fase inicial, o potencial terapêutico do tratamento de células sensíveis à IL-7 com inibidores de HDACs. Começámos por avaliar de que modo um inibidor de HDACs, denominado SAHA ou vorinostat, afeta os efeitos positivos que a estimulação com IL-7 tem na viabilidade de duas linhas celulares dependentes de IL-7, D1, uma linha derivada de timócitos murinos dependente de IL-7, e Ba/F3 transduzidas de forma estável com o recetor wild type (WT) da IL-7 (Ba/F3 WT). Observámos que o tratamento com SAHA foi capaz de reduzir o aumento de viabilidade resultante de sinalização por IL-7, consoante a concentração do inibidor. O tratamento com SAHA foi também capaz de inibir o aumento de viabilidade celular promovido pela IL-7 em diferentes tipos de amostras primárias sensíveis à IL-7. Descobrimos ainda pela primeira vez dois mecanismos complementares pelos quais inibição de HDACs afeta o eixo de sinalização da IL-7. O primeiro mecanismo envolve a redução da expressão de IL7R. Diferentes amostras primárias sensíveis à IL-7 e a linha celular TAIL7 (derivada de células humanas de LLA de origem T dependentes de IL-7) tratadas com SAHA apresentam uma menor expressão génica de IL7R, com consequente redução da presença do recetor à superfície das células e da ativação das vias de sinalização por ele mediadas. Trabalhos anteriores demonstraram que um dos fatores de transcrição importantes para a regulação da sinalização de IL-7, denominado FoxO1, pode ser acetilado, sendo a sua acetilação capaz de diminuir a sua atividade transcricional e promover a sua fosforilação inativante. Uma vez que a expressão génica do recetor da IL-7 é regulada positivamente pelo fator FoxO1, testámos se a inibição de HDACs afeta a fosforilação de FoxO1 como possível consequência do aumento de acetilação na linha celular D1. Confirmámos que o tratamento com SAHA aumenta a fosforilação de FoxO1 além da fosforilação basal induzida pela estimulação com IL-7, solidificando a hipótese de que este fator de transcrição é afetado por HDACs, e que a sua acetilação facilita a sua fosforilação, reduzindo assim a expressão génica de IL7R. Contudo, o mecanismo associado à fosforilação de FoxO1 não pode ser o único mecanismo de ação dependente de IL-7 do SAHA, uma vez que as Ba/F3 WT também são afetadas pelo tratamento com este inibidor. Estas células não expressam o IL-7R murino, apresentando apenas uma expressão estável e constitutiva do recetor da IL-7 humano WT, derivado de transdução, sob regulação de um promotor viral independente de FoxO1 ativo. Assim, alterações no estado de acetilação de FoxO1 não justificam os efeitos observados em Ba/F3 WT, pelo que deve existir outro mecanismo pelo qual HDACis afetam as vias de ativação de IL-7. Com o objetivo de explorar esta hipótese, estas células foram tratadas com SAHA e avaliámos os seus efeitos na sinalização mediada por IL-7. Curiosamente, nenhum efeito foi observado em elementos necessários em fases mais iniciais da sinalização. Contudo, conseguimos observar uma redução nos níveis de ativação de alguns elementos mais tardios na cadeia de sinalização, nomeadamente na cinase S6K e na proteína ribossomal S6, dois elementos da via PI3K/Akt/mTOR. Em resposta ao tratamento com SAHA verificámos uma redução da fosforilação destes dois elementos, mesmo na presença de IL-7, indicando que este inibidor pode interferir no grau de ativação de alguns elementos das cadeias de sinalização, reduzindo assim os efeitos da IL-7 essenciais para a sobrevivência destas células. Uma vez que os nossos estudos sugerem que a IL-7 é capaz de ativar HDACs, resolvemos determinar qual de entre as vias de sinalização ativadas por IL-7 é a via responsável pela ativação de HDACs. A ativação de JAK1 promovida pela estimulação com IL-7 parece ser essencial para a atividade das HDACs, visto que na sua ausência, após tratamento com o inibidor de JAK1/2 ruxolitinib, não se observou a esperada redução do nível de acetilação de histonas resultante da atividade de HDACs induzida pela estimulação com IL-7. Várias questões continuam ainda sem resposta, tais como, quais as HDACs ativadas pela estimulação com IL-7, e se outros fatores de transcrição importantes para a expressão do IL-7R são afetados pelo tratamento com inibidores de HDACs. Apesar da necessidade de estudos futuros, este trabalho fornece fundamentos para testar o efeito da inibição de HDACs no tratamento de ALL in vivo usando modelos animais. Apesar das questões que ficaram em aberto, conseguimos clarificar quais as principais consequências funcionais que o tratamento com inibidores de HDAC têm em células dependentes de IL-7, quer a nível da redução da expressão génica de IL7R, quer a nível da inativação das vias de sinalização por ele mediadas. Conseguimos ainda identificar JAK1 como um elemento de sinalização essencial para a ativação de HDACs dependente de IL-7. Este trabalho permitiu solidificar as bases para o estudo de HDACis para o tratamento de ALL sensível à IL-7, realçando o seu valor terapêutico. Em última análise, os resultados aqui apresentados revelam o importante elo entre IL-7 e HDACs, e consequentemente uma ligação previamente pouco reconhecida entre a sinalização de IL-7 e modificações epigenéticas.