Publicação

Approaches to control the COVID-19 pandemic

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2), é o agente patogénico responsável pela COVID-19 (do inglês coronavírus disease 2019), a pandemia que já causou mais de 250 milhões de infecções e 5 milhões de mortes em todo o mundo. O SARS-CoV-2 foi detectado e identificado pela primeira vez na cidade de Wuhan, na China, nos finais de 2019. Devido à sua rápida disseminação em vários países, a Organização Mundial de Saúde (OMS) declarou a COVID-19 como Emergência de Saúde Pública de Interesse Internacional (ESPII) e pandemia a 30 de Janeiro e 11 de Março de 2020, respetivamente. Esta dissertação de mestrado foi elaborada no âmbito de dois projetos que exploraram questões pertinentes e metodologias cruciais para o controlo da atual pandemia. O primeiro projecto teve como principal objectivo determinar a capacidade de anticorpos gerados em resposta à infecção pelo SARS CoV-2 em neutralizar as variantes do vírus. A evolução do novo coronavírus tem sido marcada pelo aparecimento de diversas ariantes, em diferentes países, alguns com rápida disseminação pelo mundo, o que provocou sérias preocupações no seio da comunidade científica internacional devido ao seu potencial de maior transmissibilidade, evasão ao sistema imunitário e severidade da doença relativamente ao vírus original. Como consequência, a OMS classificou quatro dessas variantes como variantes de preocupação (variants of concern - VOCs): Alfa, Beta, Gama e Delta, detectadas pela primeira vez no Reino Unido, África do Sul, Brasil e Índia, respectivamente. Estas variantes possuem e partilham várias mutações na proteína espícula (spike), a proteína responsável pela entrada do vírus nas células (através da ligação ao receptor celular, a enzima conversora da angiotensina 2, conhecida como ACE2) e reconhecimento por anticorpos, sendo por isso o principal alvo das vacinas contra a COVID-19. A monitorização das VOCs e das suas mutações, bem como a compreensão dos mecanismos que conferem ao vírus resistência à acção dos anticorpos neutralizantes gerados por infecção natural e pela vacinação é crucial para a gestão e controlo da pandemia. Neste sentido, foram feitos ensaios de neutralização in vitro, com soro de pacientes recuperados da COVID-19, de partículas pseudovirais que expressam a proteína spike contendo diferentes combinações das mutações mais prevalentes e reportadas nas VOCs Alfa, Beta e Gama, assim como da variante Kappa, que partilha a mesma linhagem com a variante Delta. Através desta análise pode observar-se que os pseudovírus contendo as mutações das variantes Beta e Gama diminuíram significativamente a capacidade dos anticorpos de neutralizarem a sua entrada nas células comparativamente aos pseudovírus da variante Alfa e da variante selvagem (wild type, WT), confirmando resultados descritos na literatura. Foram também confirmadas e identificadas duas mutações (E484K e S494P) no domínio de ligação da proteína spike ao receptor (receptor binding domain, RBD), capazes de reduzir a capacidade neutralizante dos anticorpos. Observou-se uma diminuição ainda mais acentuada da capacidade neutralizante quando estas mutações foram complementadas com as mutações K417N e N501Y, conhecidas por aumentar a afinidade ao receptor celular ACE2. Este efeito aditivo sugere a existência de interacções sinérgicas entre mutações, não só pela regulação da ligação de anticorpos, como também da capacidade de entrada do vírus. O ensaio de neutralização com pseudovírus descrito neste projecto é um ensaio de alto rendimento e adequado para experiências em contexto de Laboratórios de Biossegurança de Nível 2 (BSL-2), útil para a monitorização continuada da evolução das variantes do SARS-CoV-2, mas que também pode ser usado para o estudo de outros vírus altamente patogénicos num contexto envolvendo menos riscos biológicos. No segundo projecto avaliaram-se metodologias alternativas de diagnóstico da infecção pelo SARS-CoV-2, tendo como principal objectivo determinar a sensibilidade analítica da testagem molecular portranscrição reversa do RNA viral seguida de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (Reverse Transcription – quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR) do SARS-CoV-2, usando a saliva de uma população pediátrica. O método de diagnóstico padrão para a COVID-19 é a detecção do RNA viral por RT-qPCR em amostras do tracto respiratório superior. As zaragatoas oro e nasofaríngeas são as amostras biológicas de eleição para a detecção do SARS-CoV-2, no entanto a sua colheita é invasiva para crianças, envolvendo riscos acrescidos de biossegurança. A saliva tem sido apontada como uma amostra alternativa em vários estudos, e que poderá ter um grande potencial na testagem e monitorização de crianças, principalmente em contexto escolar. A campanha global de vacinação contra a COVID-19 é uma das estratégias mais promissoras para o controlo e erradicação da atual pandemia. No entanto as crianças abaixo dos 12 anos ainda não são um grupo elegível para a vacinação, o que suscita questões relativamente ao seu papel na transmissão do SARS-CoV-2 e das suas variantes. Apesar da maioria não apresentar sintomas clínicos da doença, são susceptíveis à infecção podendo transmitir o vírus para a comunidade. Neste sentido, metodologias de testagem que sejam facilmente implementadas e não invasivas são cruciais para identificar, conter e controlar os casos de infecção na população pediátrica. Para tal, validou-se o método de testagem molecular do SARS-CoV-2 usando a saliva de uma população adulta hospitalizada, simptomática para a COVID-19 e com amostras emparelhadas de zaragatoa nasofaríngea. Uma vez validado o método, este foi aplicado numa população pediátrica de 85 crianças com idade até 10 anos, tendo sido avaliados dois protocolos: com e sem extracção de RNA viral. Nos adultos, a sensibilidade do teste foi de 100%, tendo sido identificados eficientemente todos os casos de COVID-19, quer no protocolo com extracção, quer no protocolo sem extracção de RNA. Ainda na análise referente aos adultos, obteve-se uma exatidão do método de 98.0% para o protocolo com extracção e 97.9% para o protocolo sem extracção. Nas crianças, quando se comparam os resultados da saliva com os da zaragatoa nasofaríngea, obtiveram-se valores de sensibilidade, especificidade e exatidão de 84.8%, 100% e 91.8%, respectivamente, no protocolo em que se procedeu à extracção de RNA. Relativamente ao protocolo sem extracção de RNA, os mesmos parâmetros foram de 81.8%, 100% e 90.4%. Estes resultados indicam que o método é eficiente em diagnosticar casos de infecções activas do SARS-CoV-2 em crianças até 10 anos. O método revelou-se igualmente eficaz no protocolo em que não se procedeu à extracção de RNA, o que pode ser extremamente vantajoso em contextos com limitações de recursos. A aplicação deste método, bem como a complementaridade com outros testes como os testes de antigénio depende do contexto, recursos e situação epidemiológica de cada região/país. Neste sentido, a saliva surge como uma amostra promissora na monitorização da população e crianças em contexto escolar. Em suma, os dois projectos desenvolvidos nesta dissertação permitiram gerar conhecimento e desenvolver metodologias cruciais no contexto da pandemia da COVID-19. Por ainda ser um problema de saúde pública e ter ainda muitas questões em aberto, as abordagens deste trabalho são pertinentes para o futuro.
Autores principais:	Lopes, Mónica Cristina Medina
Assunto:	SARS-CoV-2 Spike Anticorpos neutralizantes Saliva Diagnóstico Teses de mestrado - 2022
Ano:	2022
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2), é o agente patogénico responsável pela COVID-19 (do inglês coronavírus disease 2019), a pandemia que já causou mais de 250 milhões de infecções e 5 milhões de mortes em todo o mundo. O SARS-CoV-2 foi detectado e identificado pela primeira vez na cidade de Wuhan, na China, nos finais de 2019. Devido à sua rápida disseminação em vários países, a Organização Mundial de Saúde (OMS) declarou a COVID-19 como Emergência de Saúde Pública de Interesse Internacional (ESPII) e pandemia a 30 de Janeiro e 11 de Março de 2020, respetivamente. Esta dissertação de mestrado foi elaborada no âmbito de dois projetos que exploraram questões pertinentes e metodologias cruciais para o controlo da atual pandemia. O primeiro projecto teve como principal objectivo determinar a capacidade de anticorpos gerados em resposta à infecção pelo SARS CoV-2 em neutralizar as variantes do vírus. A evolução do novo coronavírus tem sido marcada pelo aparecimento de diversas ariantes, em diferentes países, alguns com rápida disseminação pelo mundo, o que provocou sérias preocupações no seio da comunidade científica internacional devido ao seu potencial de maior transmissibilidade, evasão ao sistema imunitário e severidade da doença relativamente ao vírus original. Como consequência, a OMS classificou quatro dessas variantes como variantes de preocupação (variants of concern - VOCs): Alfa, Beta, Gama e Delta, detectadas pela primeira vez no Reino Unido, África do Sul, Brasil e Índia, respectivamente. Estas variantes possuem e partilham várias mutações na proteína espícula (spike), a proteína responsável pela entrada do vírus nas células (através da ligação ao receptor celular, a enzima conversora da angiotensina 2, conhecida como ACE2) e reconhecimento por anticorpos, sendo por isso o principal alvo das vacinas contra a COVID-19. A monitorização das VOCs e das suas mutações, bem como a compreensão dos mecanismos que conferem ao vírus resistência à acção dos anticorpos neutralizantes gerados por infecção natural e pela vacinação é crucial para a gestão e controlo da pandemia. Neste sentido, foram feitos ensaios de neutralização in vitro, com soro de pacientes recuperados da COVID-19, de partículas pseudovirais que expressam a proteína spike contendo diferentes combinações das mutações mais prevalentes e reportadas nas VOCs Alfa, Beta e Gama, assim como da variante Kappa, que partilha a mesma linhagem com a variante Delta. Através desta análise pode observar-se que os pseudovírus contendo as mutações das variantes Beta e Gama diminuíram significativamente a capacidade dos anticorpos de neutralizarem a sua entrada nas células comparativamente aos pseudovírus da variante Alfa e da variante selvagem (wild type, WT), confirmando resultados descritos na literatura. Foram também confirmadas e identificadas duas mutações (E484K e S494P) no domínio de ligação da proteína spike ao receptor (receptor binding domain, RBD), capazes de reduzir a capacidade neutralizante dos anticorpos. Observou-se uma diminuição ainda mais acentuada da capacidade neutralizante quando estas mutações foram complementadas com as mutações K417N e N501Y, conhecidas por aumentar a afinidade ao receptor celular ACE2. Este efeito aditivo sugere a existência de interacções sinérgicas entre mutações, não só pela regulação da ligação de anticorpos, como também da capacidade de entrada do vírus. O ensaio de neutralização com pseudovírus descrito neste projecto é um ensaio de alto rendimento e adequado para experiências em contexto de Laboratórios de Biossegurança de Nível 2 (BSL-2), útil para a monitorização continuada da evolução das variantes do SARS-CoV-2, mas que também pode ser usado para o estudo de outros vírus altamente patogénicos num contexto envolvendo menos riscos biológicos. No segundo projecto avaliaram-se metodologias alternativas de diagnóstico da infecção pelo SARS-CoV-2, tendo como principal objectivo determinar a sensibilidade analítica da testagem molecular portranscrição reversa do RNA viral seguida de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (Reverse Transcription – quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR) do SARS-CoV-2, usando a saliva de uma população pediátrica. O método de diagnóstico padrão para a COVID-19 é a detecção do RNA viral por RT-qPCR em amostras do tracto respiratório superior. As zaragatoas oro e nasofaríngeas são as amostras biológicas de eleição para a detecção do SARS-CoV-2, no entanto a sua colheita é invasiva para crianças, envolvendo riscos acrescidos de biossegurança. A saliva tem sido apontada como uma amostra alternativa em vários estudos, e que poderá ter um grande potencial na testagem e monitorização de crianças, principalmente em contexto escolar. A campanha global de vacinação contra a COVID-19 é uma das estratégias mais promissoras para o controlo e erradicação da atual pandemia. No entanto as crianças abaixo dos 12 anos ainda não são um grupo elegível para a vacinação, o que suscita questões relativamente ao seu papel na transmissão do SARS-CoV-2 e das suas variantes. Apesar da maioria não apresentar sintomas clínicos da doença, são susceptíveis à infecção podendo transmitir o vírus para a comunidade. Neste sentido, metodologias de testagem que sejam facilmente implementadas e não invasivas são cruciais para identificar, conter e controlar os casos de infecção na população pediátrica. Para tal, validou-se o método de testagem molecular do SARS-CoV-2 usando a saliva de uma população adulta hospitalizada, simptomática para a COVID-19 e com amostras emparelhadas de zaragatoa nasofaríngea. Uma vez validado o método, este foi aplicado numa população pediátrica de 85 crianças com idade até 10 anos, tendo sido avaliados dois protocolos: com e sem extracção de RNA viral. Nos adultos, a sensibilidade do teste foi de 100%, tendo sido identificados eficientemente todos os casos de COVID-19, quer no protocolo com extracção, quer no protocolo sem extracção de RNA. Ainda na análise referente aos adultos, obteve-se uma exatidão do método de 98.0% para o protocolo com extracção e 97.9% para o protocolo sem extracção. Nas crianças, quando se comparam os resultados da saliva com os da zaragatoa nasofaríngea, obtiveram-se valores de sensibilidade, especificidade e exatidão de 84.8%, 100% e 91.8%, respectivamente, no protocolo em que se procedeu à extracção de RNA. Relativamente ao protocolo sem extracção de RNA, os mesmos parâmetros foram de 81.8%, 100% e 90.4%. Estes resultados indicam que o método é eficiente em diagnosticar casos de infecções activas do SARS-CoV-2 em crianças até 10 anos. O método revelou-se igualmente eficaz no protocolo em que não se procedeu à extracção de RNA, o que pode ser extremamente vantajoso em contextos com limitações de recursos. A aplicação deste método, bem como a complementaridade com outros testes como os testes de antigénio depende do contexto, recursos e situação epidemiológica de cada região/país. Neste sentido, a saliva surge como uma amostra promissora na monitorização da população e crianças em contexto escolar. Em suma, os dois projectos desenvolvidos nesta dissertação permitiram gerar conhecimento e desenvolver metodologias cruciais no contexto da pandemia da COVID-19. Por ainda ser um problema de saúde pública e ter ainda muitas questões em aberto, as abordagens deste trabalho são pertinentes para o futuro.