Publicação

Creation of a Danio rerio mutant using CRISPR-Cas9 as a model system to study Primary Ciliary Dyskinesia (PCD)

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Os vertebrados apresentam uma organização corporal complexa com três eixos: eixo antero-posterior, o eixo dorso-ventral e o eixo esquerda-direita. As assimetrias nos eixos antero-posterior e dorso-ventral são facilmente identificáveis exteriormente. No entanto, no que diz respeito ao eixo esquerda direita, as diferenças são notadas unicamente na disposição interna dos órgãos. No Homem, o coração está deslocado para o lado esquerdo, assim como o estômago e o baço, enquanto que o fígado e a vesícula biliar ficam do lado direito. Também os pulmões, devido à posição do coração, apresentam assimetria no número de lóbulos. Esta disposição (situs solitus) é determinada cedo durante o desenvolvimento embrionário e mantem-se conservada nos vertebrados. A diferenciação do eixo esquerda-direita é precedida por assimetrias na expressão de genes no organizador esquerda-direita (LRO, na sigla em inglês). O LRO é uma estrutura transiente localizada no final da notocorda, que no peixe-zebra é chamada de vesícula de Kupffer (KV). Esta vesícula é formada por células, cada uma com um cílio diferenciado na sua membrana apical. A maioria destes cílios são móveis e com o seu movimento coordenado produzem um fluxo direcionado para o lado esquerdo do LRO. Esta assimetria no fluxo é depois transferida para uma assimetria na expressão de genes nos tecidos à volta do LRO. Inicialmente há dois genes que são expressos de forma simétrica à volta do LRO: nodal e cerl2. A forma como o fluxo consegue controlar a expressão de nodal e cerl2 ainda não é conhecida, mas foram propostas duas hipóteses que a tentam explicar. A primeira propõe que o fluxo gerado pelos cílios móveis transporta substâncias secretadas pelo LRO e as concentra do lado esquerdo, levando à assimetria na expressão nodal e cerl2 verificada posteriormente. A outra hipótese propõe que os cílios móveis criam o fluxo de fluído que, no lado esquerdo, vai causar a deflação dos cílios imóveis, estimulando os seus mecanorecetores e induzindo uma via de ativação dependente de Ca2+ que culmina na expressão assimétrica de nodal e cerl2. No entanto, apesar dos esforços, ambas as hipóteses têm sido questionadas e o exacto mecanismo de transdução da informação permanece desconhecido. Após a ação do fluxo, que é sentido pelas células que rodeiam o LRO, a expressão de cerl2 é inibida no lado esquerdo. A inibição da expressão de cerl2 (inibidor de nodal) permite uma maior expressão de nodal e consequentemente a ativação da cascata de sinalização Nodal-Lefty-Pitx2. Pitx2 é a proteína efetora da cascata iniciada por Nodal, sendo apontada como a responsável por induzir o fenótipo “esquerdo” nas células do lado esquerdo da mesoderme lateral (L-LPM). Os cílios, que podem ser móveis ou imóveis (primários), estão presentes em quase todos os tipos células nos vertebrados e por isso, são determinantes quer no período de desenvolvimento embrionário quer na idade adulta. Quando o seu funcionamento fica comprometido pode desencadear várias doenças, como por exemplo a doença do rim poliquístico (PKD, na sigla em inglês) ou síndromes somáticas associadas a polidactilia, malformações neurológicas ou obesidade, no caso de alterações associadas aos cílios primários. Quando são os cílios móveis afetados, as alterações manifestam-se através de infertilidade, infeções respiratórias recorrentes e situs inversus que caracterizam a uma condição chamada discinesia ciliar primaria (PCD). A PCD afecta 1 em cada 10 000 nascimentos e é uma das causas de defeitos cardíacos congénitos. A presença de heterotaxia, condição na qual, pelo menos um órgão está no lado oposto ao que seria de esperar, aumenta 200 vezes a prevalência destes defeitos congénitos. A PC pode ser causada por mutações que alterem ou inibam a produção de qualquer um dos componentes necessários à montagem das estruturas essenciais para o movimento dos cílios, como o par central, os raios, o complexo regulador da nexina, os braços interno e externo de dineínas ou outras proteínas citoplasmáticas que participam na montagem de componentes ciliares. Este trabalho foca-se na proteína ccdc40, que é um dos componentes do braço interno de dineínas. Esta proteína é também responsável pela poliglutamilação dos microtúbulos contribuindo para a sua estabilização. Além disso, a proteína Ccdc40 forma um complexo com outra, a Ccdc39, e atua como uma régua molecular. Este complexo permite que os raios dos cílios apenas se liguem no local devido ao longo dos microtúbulos, isto é, a cada 96 nm. Na sua ausência, estes raios continuam a ligar-se aos microtúbulos, mas em locais onde isso não era suposto acontecer. Em pacientes com PCD portadores de alterações neste gene, foram identificados locais da proteína onde as mutações são mais frequentemente encontradas: as mutações c.248delC e c.3129delC alteram a grelha de leitura enquanto que as outras (c.2440 C>T, c.961 C>T e c.1345C>T) produzem proteínas truncadas. Neste trabalho, pretendeu-se criar um peixe-zebra mutante que produza a proteína Ccdc40 truncada e que possa servir como modelo de doença para estudar o impacto das mutações mais perto do terminal N da proteína (c.248delC e c.961 C>T). Estas mutações próximas da extremidade N representam cerca de 50% dos casos de mutações identificadas neste gene e produzem proteínas sem o domínio helicoidal (coiled-coil). Para produzir este mutante usou-se o sistema CRISPR-Cas9. Este sistema foi adaptado a partir de um mecanismo de defesa descoberto em bactérias e permite direcionar a Cas9 (DNase) para um local específico do genoma, usando uma sequência guia de RNA complementar ao local escolhido. Uma vez clivado o DNA, a célula inicia o processo de reparação através da junção das extremidades não homólogas (NHEJ), processo este que é propenso à inserção ou remoção de bases azotadas, levando à ocorrência de mutações que podem inativar a proteína. Neste caso, o local escolhido como alvo da Cas9 foi a zona do genoma que codifica para o aminoácido 116 da proteína ccdc40 no peixe zebra. Esta região é homóloga da região do genoma humano onde ocorre a mutação c.961 C>T. Uma mutação nonesense ou uma alteração da grelha na leitura neste local impede totalmente a tradução do domínio em hélice, o que causa alterações na montagem da estrutura interna dos cílios e consequentemente na sua mobilidade. De forma a poder estudar e futuramente validar o fenótipo resultante da injeção do morfolino bloqueador da tradução, foram analisados a posição do coração, fígado e pâncreas assim como defeitos na cauda e aparecimento de edema cardíaco, em embriões injetados com o morfolino. Os resultados mostraram que, independentemente da concentração injetada, os embriões apresentam defeitos relativos à posição do coração (coração à direita ou ao centro), fígado e pâncreas, assim como curvaturas na cauda e aparecimento de edema por volta dos 3dpf. Estes resultados, irão futuramente ser comparados com o fenótipo observado no mutante produzido, validando ou não este morfolino. Além disso, este mutante permitirá estudar as alterações estruturais e funcionais dos cílios em que a proteína Ccdc40 apresenta uma mutação próxima da extremidade N e compará-las com a estrutura dos cílios de outa linha mutante já existente, lok, em que a proteína é mutada próximo da extremidade C e ainda possui parte do domínio helicoidal. Futuramente, este mutante poderá ser útil para testar terapia génica direcionada à correção desta mutação que poderá mais tarde ser reproduzida em células humanas recolhidas de pacientes com PCD com o intuito de serem reimplantadas, possibilitando uma forma de tratamento que possa minimizar os efeitos da PCD no aparelho respiratório.
Autores principais:	Rasteiro, Margarida Oliveira Almeida
Assunto:	Cílios móveis Discinesia ciliar primária Ccdc40 CRISPR-Cas9 Peixe-zebra Teses de mestrado - 2017
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Os vertebrados apresentam uma organização corporal complexa com três eixos: eixo antero-posterior, o eixo dorso-ventral e o eixo esquerda-direita. As assimetrias nos eixos antero-posterior e dorso-ventral são facilmente identificáveis exteriormente. No entanto, no que diz respeito ao eixo esquerda direita, as diferenças são notadas unicamente na disposição interna dos órgãos. No Homem, o coração está deslocado para o lado esquerdo, assim como o estômago e o baço, enquanto que o fígado e a vesícula biliar ficam do lado direito. Também os pulmões, devido à posição do coração, apresentam assimetria no número de lóbulos. Esta disposição (situs solitus) é determinada cedo durante o desenvolvimento embrionário e mantem-se conservada nos vertebrados. A diferenciação do eixo esquerda-direita é precedida por assimetrias na expressão de genes no organizador esquerda-direita (LRO, na sigla em inglês). O LRO é uma estrutura transiente localizada no final da notocorda, que no peixe-zebra é chamada de vesícula de Kupffer (KV). Esta vesícula é formada por células, cada uma com um cílio diferenciado na sua membrana apical. A maioria destes cílios são móveis e com o seu movimento coordenado produzem um fluxo direcionado para o lado esquerdo do LRO. Esta assimetria no fluxo é depois transferida para uma assimetria na expressão de genes nos tecidos à volta do LRO. Inicialmente há dois genes que são expressos de forma simétrica à volta do LRO: nodal e cerl2. A forma como o fluxo consegue controlar a expressão de nodal e cerl2 ainda não é conhecida, mas foram propostas duas hipóteses que a tentam explicar. A primeira propõe que o fluxo gerado pelos cílios móveis transporta substâncias secretadas pelo LRO e as concentra do lado esquerdo, levando à assimetria na expressão nodal e cerl2 verificada posteriormente. A outra hipótese propõe que os cílios móveis criam o fluxo de fluído que, no lado esquerdo, vai causar a deflação dos cílios imóveis, estimulando os seus mecanorecetores e induzindo uma via de ativação dependente de Ca2+ que culmina na expressão assimétrica de nodal e cerl2. No entanto, apesar dos esforços, ambas as hipóteses têm sido questionadas e o exacto mecanismo de transdução da informação permanece desconhecido. Após a ação do fluxo, que é sentido pelas células que rodeiam o LRO, a expressão de cerl2 é inibida no lado esquerdo. A inibição da expressão de cerl2 (inibidor de nodal) permite uma maior expressão de nodal e consequentemente a ativação da cascata de sinalização Nodal-Lefty-Pitx2. Pitx2 é a proteína efetora da cascata iniciada por Nodal, sendo apontada como a responsável por induzir o fenótipo “esquerdo” nas células do lado esquerdo da mesoderme lateral (L-LPM). Os cílios, que podem ser móveis ou imóveis (primários), estão presentes em quase todos os tipos células nos vertebrados e por isso, são determinantes quer no período de desenvolvimento embrionário quer na idade adulta. Quando o seu funcionamento fica comprometido pode desencadear várias doenças, como por exemplo a doença do rim poliquístico (PKD, na sigla em inglês) ou síndromes somáticas associadas a polidactilia, malformações neurológicas ou obesidade, no caso de alterações associadas aos cílios primários. Quando são os cílios móveis afetados, as alterações manifestam-se através de infertilidade, infeções respiratórias recorrentes e situs inversus que caracterizam a uma condição chamada discinesia ciliar primaria (PCD). A PCD afecta 1 em cada 10 000 nascimentos e é uma das causas de defeitos cardíacos congénitos. A presença de heterotaxia, condição na qual, pelo menos um órgão está no lado oposto ao que seria de esperar, aumenta 200 vezes a prevalência destes defeitos congénitos. A PC pode ser causada por mutações que alterem ou inibam a produção de qualquer um dos componentes necessários à montagem das estruturas essenciais para o movimento dos cílios, como o par central, os raios, o complexo regulador da nexina, os braços interno e externo de dineínas ou outras proteínas citoplasmáticas que participam na montagem de componentes ciliares. Este trabalho foca-se na proteína ccdc40, que é um dos componentes do braço interno de dineínas. Esta proteína é também responsável pela poliglutamilação dos microtúbulos contribuindo para a sua estabilização. Além disso, a proteína Ccdc40 forma um complexo com outra, a Ccdc39, e atua como uma régua molecular. Este complexo permite que os raios dos cílios apenas se liguem no local devido ao longo dos microtúbulos, isto é, a cada 96 nm. Na sua ausência, estes raios continuam a ligar-se aos microtúbulos, mas em locais onde isso não era suposto acontecer. Em pacientes com PCD portadores de alterações neste gene, foram identificados locais da proteína onde as mutações são mais frequentemente encontradas: as mutações c.248delC e c.3129delC alteram a grelha de leitura enquanto que as outras (c.2440 C>T, c.961 C>T e c.1345C>T) produzem proteínas truncadas. Neste trabalho, pretendeu-se criar um peixe-zebra mutante que produza a proteína Ccdc40 truncada e que possa servir como modelo de doença para estudar o impacto das mutações mais perto do terminal N da proteína (c.248delC e c.961 C>T). Estas mutações próximas da extremidade N representam cerca de 50% dos casos de mutações identificadas neste gene e produzem proteínas sem o domínio helicoidal (coiled-coil). Para produzir este mutante usou-se o sistema CRISPR-Cas9. Este sistema foi adaptado a partir de um mecanismo de defesa descoberto em bactérias e permite direcionar a Cas9 (DNase) para um local específico do genoma, usando uma sequência guia de RNA complementar ao local escolhido. Uma vez clivado o DNA, a célula inicia o processo de reparação através da junção das extremidades não homólogas (NHEJ), processo este que é propenso à inserção ou remoção de bases azotadas, levando à ocorrência de mutações que podem inativar a proteína. Neste caso, o local escolhido como alvo da Cas9 foi a zona do genoma que codifica para o aminoácido 116 da proteína ccdc40 no peixe zebra. Esta região é homóloga da região do genoma humano onde ocorre a mutação c.961 C>T. Uma mutação nonesense ou uma alteração da grelha na leitura neste local impede totalmente a tradução do domínio em hélice, o que causa alterações na montagem da estrutura interna dos cílios e consequentemente na sua mobilidade. De forma a poder estudar e futuramente validar o fenótipo resultante da injeção do morfolino bloqueador da tradução, foram analisados a posição do coração, fígado e pâncreas assim como defeitos na cauda e aparecimento de edema cardíaco, em embriões injetados com o morfolino. Os resultados mostraram que, independentemente da concentração injetada, os embriões apresentam defeitos relativos à posição do coração (coração à direita ou ao centro), fígado e pâncreas, assim como curvaturas na cauda e aparecimento de edema por volta dos 3dpf. Estes resultados, irão futuramente ser comparados com o fenótipo observado no mutante produzido, validando ou não este morfolino. Além disso, este mutante permitirá estudar as alterações estruturais e funcionais dos cílios em que a proteína Ccdc40 apresenta uma mutação próxima da extremidade N e compará-las com a estrutura dos cílios de outa linha mutante já existente, lok, em que a proteína é mutada próximo da extremidade C e ainda possui parte do domínio helicoidal. Futuramente, este mutante poderá ser útil para testar terapia génica direcionada à correção desta mutação que poderá mais tarde ser reproduzida em células humanas recolhidas de pacientes com PCD com o intuito de serem reimplantadas, possibilitando uma forma de tratamento que possa minimizar os efeitos da PCD no aparelho respiratório.