Publicação

Involvement of aquaporins in pancreatic cancer and melanoma: effect of metallodrugs on cell migration

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As aquaporinas (AQPs) são canais de membrana amplamente distribuídos em organismos vivos e geralmente preservados em mamíferos, incluindo roedores e humanos. Devido ao seu envolvimento em uma ampla gama de funções fisiológicas e doenças humanas, essas proteínas da membrana foram consideradas com grande potencial como alvos terapêuticos e descoberta de novos fármacos. A identificação e estudo de inibidores aquaporinas, canais proteicos de membrana altamente conservados permeáveis à água, glicerol, peróxido de hidrogénio e outros pequenos solutos como a ureia, desperta cada vez mais interesse. Os últimos anos foram muitos importantes para a compreensão dos diversos papéis das AQPs na saúde e na doença, particularmente, na capacidade das AQPs de permear não apenas água, mas também outras pequenas moléculas ou solutos, permitindo regular várias funções como volume celular, metabolismo energético, migração, adesão e proliferação. Até ao presente foram identificadas 13 isoformas de aquaporinas (AQP0-12) em mamíferos, distribuídas por todos os tecidos. Com base nas características funcionais e estruturais, as aquaporinas classificam-se em aquaporinas ortodoxas, estritamente envolvidas na permeabilidade à água (AQP0-2, AQP4, AQP5, AQP6 e AQP8) e aquagliceroporinas, facilitando o transporte de pequenos solutos não carregados como glicerol e ureia, adicionalmente à água (AQP3, AQP7, AQP9 e AQP10). As peroxiporinas (AQP1, AQP3, AQP5, AQP8 e AQP9) são uma subclasse de aquaporinas permeáveis ao peróxido de hidrogénio. Por fim, e devido à sua localização subcelular, as AQP11 e AQP12 são classificadas como S-aquaporinas, mostrando menor similaridade de sequência com as outras isoformas. A permeabilidade seletiva da AQP12 ainda não é certa. No entanto, existem indicações de que a AQP11 facilita o transporte de água e glicerol. Estudos clínicos e pré-clínicos mostram evidências de que a expressão de algumas AQPs aumenta em muitos tipos diferentes de cancro. De facto, devido ao seu papel importante no movimento transmembranar da água em resposta a gradientes osmóticos, bem como na captação de glicerol celular para síntese lipídica ou produção de ATP, as AQPs facilitam o crescimento do tumor, a infiltração local e as metástases, aumentando a migração celular, a angiogénese, a adesão da matriz celular e a interação com oncogenes. Estudos in vivo e in vitro mostraram oportunidades atraentes para a terapia direcionada para AQPs. O adenocarcinoma pancreático (PA) é uma doença agressiva que se desenvolve de maneira relativamente assintomática e que geralmente está avançada no momento do diagnóstico. Como é comum em tumores epiteliais, a carcinogénese desenvolve-se através da acumulação de mutações e lesões genéticas, levando à ativação de oncogenes e inativação de genes supressores de tumores. É necessário um entendimento completo dos mecanismos celulares e moleculares específicos do desenvolvimento e progressão do PA, a fim de identificar estratégias de deteção precoce, medidas preventivas e intervenções eficazes. O mau prognóstico do PA deve-se em parte à falta de informações fisiológicas sobre o desenvolvimento da doença. Linhas celulares estabelecidas continuam a ser uma ferramenta útil para investigar estes processos biológicos moleculares. O melanoma é um cancro que começa nos melanócitos. A maioria das células de melanoma ainda produz melanina, de modo que este tipo de tumores são, geralmente, castanhos ou pretos. Alguns melanomas não produzem melanina de modo que a lesão pode ser rosa, bege ou mesmo branca. Os melanomas podem desenvolver-se em qualquer parte da pele, no entanto, é mais provável o seu desenvolvimento no tronco (peito e costas) nos homens e nas pernas das mulheres. O pescoço e o rosto são outros locais comuns. A expressão elevada de AQP3 foi descrita em melanoma, e considerada como potencial alvo terapêutico. Estudos anteriores do nosso grupo, usando técnicas de imuno-histoquímica, mostraram que a AQP3 e a AQP5 são aberrantemente expressas em biópsias humanas de adenocarcinoma pancreático. Assim, neste trabalho investigámos o envolvimento de AQP3 e AQP5 na permeabilidade da membrana celular, proliferação celular e migração de células de adenocarcinoma pancreático humano (BxPC3) e melanoma humano (MNT-1), para validar seu potencial como biomarcadores e potenciais alvos terapêuticos. Para tal avaliámos a expressão de AQPs numa linha celular de adenocarcinoma pancreático e noutra de melanoma humano, assim como a permeabilidade da membrana à água e ao glicerol. Verificámos que a AQP3 é a isoforma mais abundantemente expressa em ambas as linhas celulares, enquanto que a AQP5 também está presente, mas em muito menor quantidade. As células BxPC3 apresentam maior valor de Pf do de que Pgly, tal como as células MNT-1, confirmando o papel preponderante da AQP3 (aquagliceroporina) o que já era espectável uma vez que ambas as aquaporinas presentes (AQP3 e AQP5) são permeáveis à água e apenas a AQP3 é aquagliceroporina, e apresenta permeabilidade ao glicerol. Estudos anteriores demonstram a difusão de peróxido de hidrogénio através da membrana, e por isso avaliou-se a influência do stress oxidativo nas células de adenocarcinoma pancreático (BxPC3). Conclui-se que, com diferentes tempos de incubação, o efeito do H2O2 não apresenta diferenças significativas na viabilidade celular até à concentração de 200mM. No entanto, a migração celular das mesmas células é afetada na presença do peróxido de hidrogénio, sofrendo uma redução de 50% após 12h de exposição. Posteriormente, foi avaliado o efeito citotóxico de compostos metálicos (ouro, vanádio e polioxometalatos) apontados como potenciais inibidores de aquaporinas e comparados com o efeito de compostos de ouro, reconhecidos como potentes inibidores da AQP3. Os compostos de ouro demonstraram afetar a viabilidade celular tanto em células pancreáticas como em células de melanoma humano, havendo uma redução de células viáveis para 50% ao fim de 24h de exposição aos mesmos. No ensaio de migração celular com estes compostos, esta também sofreu alterações. Ao fim de 24h, cerca de 40% da lesão das células controlo de adenocarcinoma pancreático continuava aberta enquanto a lesão do controlo fechou na totalidade. Nas células de melanoma humano observaram-se perturbações na velocidade de migração, no entanto, as células não perderam a capacidade de migrar com 5 µM de composto e ao fim de 24h estavam praticamente ao nível do controlo, com 100% da lesão fechada. Os compostos de vanádio, tal como os de ouro, afetaram a migração e viabilidade celular. Nas células pancreáticas a viabilidade celular, ao fim de 24h, ficou inferior a 50%, por outro lado, nas células de melanoma humano a viabilidade manteve-se acima do nível dos 50%. Estes factos corroboram com os resultados da migração celular, em que as células de melanoma conseguiram capacidade de migração para fechar a lesão tal como o controlo. Nas células pancreáticas, nem o controlo nem as células expostas aos compostos conseguiram fechar a lesão na totalidade. Os compostos de tungstato, não revelaram muito efeito na viabilidade celular até uma concentração de 20 µM, havendo sempre mais 50% das células viáveis. Na migração celular, tanto o POT-A como o POT-C, afetaram as células pancreáticas e de melanoma. Após 24h de exposição aos compostos, as células pancreáticas migraram cerca de 60% com o POT-A e 80% com o POT-C, comparativamente ao controlo. Já as de melanoma migraram cerca de 70% e 90%, na presença do POT-A e POT-C, respetivamente. Por último, avaliou-se o efeito dos compostos em estudo na permeabilidade das células pancreáticas e de melanoma humano. Nas células BxPC3, quando comparado com o controlo a permeabilidade é drasticamente reduzida, principalmente com o POT-A, ficando inferior a 20%. As células em junção com o Auphen, inibidor de AQP3 já anteriormente descrito, sofrem uma redução de permeabilidade de 100% para cerca de 20%. Já nas células de melanoma, na presença do Auphen, a permeabilidade é reduzida, mas mantêm-se acima dos 50%. Em suma, todos os compostos são promissores e merecem um estudo mais detalhado e pormenorizado. Deve-se ainda testar o efeito destes compostos noutros tipos de cancro.
Autores principais:	Coxixo, Ana Sofia Generoso
Assunto:	Aquaporinas Migração celular Cancro do pâncreas Melanoma Inibidores Teses de mestrado - 2019
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	As aquaporinas (AQPs) são canais de membrana amplamente distribuídos em organismos vivos e geralmente preservados em mamíferos, incluindo roedores e humanos. Devido ao seu envolvimento em uma ampla gama de funções fisiológicas e doenças humanas, essas proteínas da membrana foram consideradas com grande potencial como alvos terapêuticos e descoberta de novos fármacos. A identificação e estudo de inibidores aquaporinas, canais proteicos de membrana altamente conservados permeáveis à água, glicerol, peróxido de hidrogénio e outros pequenos solutos como a ureia, desperta cada vez mais interesse. Os últimos anos foram muitos importantes para a compreensão dos diversos papéis das AQPs na saúde e na doença, particularmente, na capacidade das AQPs de permear não apenas água, mas também outras pequenas moléculas ou solutos, permitindo regular várias funções como volume celular, metabolismo energético, migração, adesão e proliferação. Até ao presente foram identificadas 13 isoformas de aquaporinas (AQP0-12) em mamíferos, distribuídas por todos os tecidos. Com base nas características funcionais e estruturais, as aquaporinas classificam-se em aquaporinas ortodoxas, estritamente envolvidas na permeabilidade à água (AQP0-2, AQP4, AQP5, AQP6 e AQP8) e aquagliceroporinas, facilitando o transporte de pequenos solutos não carregados como glicerol e ureia, adicionalmente à água (AQP3, AQP7, AQP9 e AQP10). As peroxiporinas (AQP1, AQP3, AQP5, AQP8 e AQP9) são uma subclasse de aquaporinas permeáveis ao peróxido de hidrogénio. Por fim, e devido à sua localização subcelular, as AQP11 e AQP12 são classificadas como S-aquaporinas, mostrando menor similaridade de sequência com as outras isoformas. A permeabilidade seletiva da AQP12 ainda não é certa. No entanto, existem indicações de que a AQP11 facilita o transporte de água e glicerol. Estudos clínicos e pré-clínicos mostram evidências de que a expressão de algumas AQPs aumenta em muitos tipos diferentes de cancro. De facto, devido ao seu papel importante no movimento transmembranar da água em resposta a gradientes osmóticos, bem como na captação de glicerol celular para síntese lipídica ou produção de ATP, as AQPs facilitam o crescimento do tumor, a infiltração local e as metástases, aumentando a migração celular, a angiogénese, a adesão da matriz celular e a interação com oncogenes. Estudos in vivo e in vitro mostraram oportunidades atraentes para a terapia direcionada para AQPs. O adenocarcinoma pancreático (PA) é uma doença agressiva que se desenvolve de maneira relativamente assintomática e que geralmente está avançada no momento do diagnóstico. Como é comum em tumores epiteliais, a carcinogénese desenvolve-se através da acumulação de mutações e lesões genéticas, levando à ativação de oncogenes e inativação de genes supressores de tumores. É necessário um entendimento completo dos mecanismos celulares e moleculares específicos do desenvolvimento e progressão do PA, a fim de identificar estratégias de deteção precoce, medidas preventivas e intervenções eficazes. O mau prognóstico do PA deve-se em parte à falta de informações fisiológicas sobre o desenvolvimento da doença. Linhas celulares estabelecidas continuam a ser uma ferramenta útil para investigar estes processos biológicos moleculares. O melanoma é um cancro que começa nos melanócitos. A maioria das células de melanoma ainda produz melanina, de modo que este tipo de tumores são, geralmente, castanhos ou pretos. Alguns melanomas não produzem melanina de modo que a lesão pode ser rosa, bege ou mesmo branca. Os melanomas podem desenvolver-se em qualquer parte da pele, no entanto, é mais provável o seu desenvolvimento no tronco (peito e costas) nos homens e nas pernas das mulheres. O pescoço e o rosto são outros locais comuns. A expressão elevada de AQP3 foi descrita em melanoma, e considerada como potencial alvo terapêutico. Estudos anteriores do nosso grupo, usando técnicas de imuno-histoquímica, mostraram que a AQP3 e a AQP5 são aberrantemente expressas em biópsias humanas de adenocarcinoma pancreático. Assim, neste trabalho investigámos o envolvimento de AQP3 e AQP5 na permeabilidade da membrana celular, proliferação celular e migração de células de adenocarcinoma pancreático humano (BxPC3) e melanoma humano (MNT-1), para validar seu potencial como biomarcadores e potenciais alvos terapêuticos. Para tal avaliámos a expressão de AQPs numa linha celular de adenocarcinoma pancreático e noutra de melanoma humano, assim como a permeabilidade da membrana à água e ao glicerol. Verificámos que a AQP3 é a isoforma mais abundantemente expressa em ambas as linhas celulares, enquanto que a AQP5 também está presente, mas em muito menor quantidade. As células BxPC3 apresentam maior valor de Pf do de que Pgly, tal como as células MNT-1, confirmando o papel preponderante da AQP3 (aquagliceroporina) o que já era espectável uma vez que ambas as aquaporinas presentes (AQP3 e AQP5) são permeáveis à água e apenas a AQP3 é aquagliceroporina, e apresenta permeabilidade ao glicerol. Estudos anteriores demonstram a difusão de peróxido de hidrogénio através da membrana, e por isso avaliou-se a influência do stress oxidativo nas células de adenocarcinoma pancreático (BxPC3). Conclui-se que, com diferentes tempos de incubação, o efeito do H2O2 não apresenta diferenças significativas na viabilidade celular até à concentração de 200mM. No entanto, a migração celular das mesmas células é afetada na presença do peróxido de hidrogénio, sofrendo uma redução de 50% após 12h de exposição. Posteriormente, foi avaliado o efeito citotóxico de compostos metálicos (ouro, vanádio e polioxometalatos) apontados como potenciais inibidores de aquaporinas e comparados com o efeito de compostos de ouro, reconhecidos como potentes inibidores da AQP3. Os compostos de ouro demonstraram afetar a viabilidade celular tanto em células pancreáticas como em células de melanoma humano, havendo uma redução de células viáveis para 50% ao fim de 24h de exposição aos mesmos. No ensaio de migração celular com estes compostos, esta também sofreu alterações. Ao fim de 24h, cerca de 40% da lesão das células controlo de adenocarcinoma pancreático continuava aberta enquanto a lesão do controlo fechou na totalidade. Nas células de melanoma humano observaram-se perturbações na velocidade de migração, no entanto, as células não perderam a capacidade de migrar com 5 µM de composto e ao fim de 24h estavam praticamente ao nível do controlo, com 100% da lesão fechada. Os compostos de vanádio, tal como os de ouro, afetaram a migração e viabilidade celular. Nas células pancreáticas a viabilidade celular, ao fim de 24h, ficou inferior a 50%, por outro lado, nas células de melanoma humano a viabilidade manteve-se acima do nível dos 50%. Estes factos corroboram com os resultados da migração celular, em que as células de melanoma conseguiram capacidade de migração para fechar a lesão tal como o controlo. Nas células pancreáticas, nem o controlo nem as células expostas aos compostos conseguiram fechar a lesão na totalidade. Os compostos de tungstato, não revelaram muito efeito na viabilidade celular até uma concentração de 20 µM, havendo sempre mais 50% das células viáveis. Na migração celular, tanto o POT-A como o POT-C, afetaram as células pancreáticas e de melanoma. Após 24h de exposição aos compostos, as células pancreáticas migraram cerca de 60% com o POT-A e 80% com o POT-C, comparativamente ao controlo. Já as de melanoma migraram cerca de 70% e 90%, na presença do POT-A e POT-C, respetivamente. Por último, avaliou-se o efeito dos compostos em estudo na permeabilidade das células pancreáticas e de melanoma humano. Nas células BxPC3, quando comparado com o controlo a permeabilidade é drasticamente reduzida, principalmente com o POT-A, ficando inferior a 20%. As células em junção com o Auphen, inibidor de AQP3 já anteriormente descrito, sofrem uma redução de permeabilidade de 100% para cerca de 20%. Já nas células de melanoma, na presença do Auphen, a permeabilidade é reduzida, mas mantêm-se acima dos 50%. Em suma, todos os compostos são promissores e merecem um estudo mais detalhado e pormenorizado. Deve-se ainda testar o efeito destes compostos noutros tipos de cancro.