Publicação

Crosstalk between the miRNA and the SnRK1 signalling pathways

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As plantas, devido à sua incapacidade de locomoção, estão confinadas ao local onde germinaram sendo, por isso, vulneráveis a condições ambientais que restringem o seu crescimento e desenvolvimento. Temperaturas extremas, seca, inundações, elevada salinidade, exposição a metais pesados, lesões mecânicas, condições de luz inadequadas e infeção por patogéneos estão entre as maiores causas de perda de produtividade agrícola a nível mundial. Para fazer face a estas flutuações ambientais, as plantas desenvolveram, por um lado, estratégias adaptativas de sobrevivência de carácter específico, que lhes permitem responder a um tipo particular de stress e, por outro, mecanismos gerais responsáveis pelo ajuste metabólico e pela reprogramação da expressão de genes, permitindo, assim, rapidamente reparar os componentes celulares danificados e alocar nutrientes para os processos adequados, de forma a restaurar a homeostasia. Em condições normais, as plantas convertem a luz em energia química sob a forma de açúcares que são depois distribuídos pelos vários órgãos da planta permitindo o seu correto crescimento e desenvolvimento. Contudo, condições desfavoráveis com impacto deletério nos processos de fotossíntese e respiração resultam, frequentemente, na diminuição dos níveis de energia celular da planta e afetam a alocação de açúcares para os órgãos em crescimento, levando à ativação da proteína cinase SnRK1. Esta, por sua vez, para restabelecer a homeostasia, ativa processos catabólicos e inibe processos anabólicos através da fosforilação de diversas enzimas metabólicas e de uma extensa reprogramação do transcriptoma, permitindo, assim, a aclimatação e sobrevivência das plantas. A SnRK1 pertence a uma família altamente conservada de cinases e partilha semelhanças estruturais e funcionais com as proteínas ortólogas “AMP-activated protein kinase” (AMPK), nos mamíferos, e “Sucrose non-fermenting 1” (SNF1), nas leveduras, funcionando como um complexo heterotrimérico composto por uma subunidade catalítica α e duas subunidades regulatórias, β e γ. Em Arabidopsis, existem três diferentes isoformas de SnRK1α, apesar de apenas duas (codificadas pelos genes SnRK1α1/KIN10 e SnRK1α2/KIN11) serem expressas constitutivamente em todos os tecidos da planta, três diferentes isoformas de SnRK1β (codificadas pelos genes SnRK1β1, SnRK1β2 e SnRK1β3) e apenas uma isoforma da subunidade γ, SnRK1βγ. Não obstante a sua enorme importância a nível da resposta a diferentes tipos de stress, a via de sinalização da SnRK1 vai além do mero ajuste metabólico nessas condições, estando igualmente implicada na sinalização de açúcares, associada a vias de sinalização mediadas por várias hormonas vegetais e envolvida na modulação do crescimento e desenvolvimento das plantas. Contudo, apesar do seu papel central, são poucos os mecanismos descritos, até à data, capazes de explicar a reprogramação transcripcional desencadeada pela SnRK1. O aumento da expressão de determinados genes, por seu lado, é atribuído em grande parte a fatores de transcrição “basic leucine Zipper” (bZIP) bem estabelecidos enquanto efetores a jusante da via de sinalização da SnRK1. Por outro lado, quanto à repressão de genes, os mecanismos subjacentes continuam maioritariamente desconhecidos, embora os microRNAs (miRNAs) tenham sido implicados na repressão de alguns dos alvos de SnRK1, ainda que através de mecanismos desconhecidos. Os miRNAs correspondem a uma classe de pequenos RNAs endógenos não codificantes com 20-24 nucleótidos que regulam a expressão de genes pós-transcricionalmente, através da clivagem e/ou do bloqueio da tradução de transcritos complementares. Desta forma, os miRNAs têm sido extensivamente implicados tanto no crescimento e desenvolvimento das plantas como na resposta a fatores de stress biótico e abiótico. O trabalho desenvolvido nesta tese de mestrado teve como principal objetivo aumentar o conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na comunicação entre a via de sinalização de SnRK1 e os miRNAs. Para isso, foram testadas duas hipóteses não mutuamente exclusivas: a) SnRK1 afeta a biogénese de miRNAs e b) SnRK1 afeta a atividade de miRNAs. A biogénese de miRNAs ocorre no núcleo, englobando várias processos interdependentes desempenhados por componentes organizados num complexo. Em linhas gerais, a RNA Polimerase II (Pol II) é recrutada para o gene MIR, promovendo a sua transcrição e dando origem a um miRNA primário (pri-miRNA) que é processado pela proteína “DICER-like 1” (DCL1) com o auxílio das proteínas “Hyponastic-leaves 1” (HYL1) e “Serrate” (SE), originando um percursor de miRNA (pré-miRNA). Este pré-miRNA é novamente processado pela DCL1, originando uma pequena cadeia dupla formada por miRNA/miRNA, que constituem respectivamente a cadeia guia e a cadeia passageira. A extremidade 3’ do duplex miRNA/miRNA é metilada pela metil-transferase “Hua-Enhancer 1” (HEN1). Ainda no núcleo, a cadeia passageira é normalmente alvo de degradação e a cadeia guia, que constitui o miRNA maduro, é reconhecida e incorporada no complexo “RNA-induced Silencing Complex” (RISC). Este complexo tem como principal efetor uma proteína da família “ARGONAUTE” (AGO), responsável pelo reconhecimento, já no citoplasma, de transcritos-alvo com sequência complementar à do miRNA, e pela sua subsequente clivagem ou bloqueio de tradução. Problemas na biogénese de miRNAs refletem-se, normalmente, num aumento de pri-miRNAs e numa acumulação deficiente de miRNAs maduros. Deste modo, para testar a primeira hipótese, comecei por analisar a acumulação de dois miRNAs específicos – miR156 e miR319 – em plantas Arabidopsis tipo silvestre e em mutantes com perda parcial de função de SnRK1. Os resultados mostraram que a inativação parcial de SnRK1 levou à redução dos níveis de expressão de ambos os miRNAs testados. Ainda que não se consiga apurar por agora se este é um efeito específico para os miRNAs testados ou se se trata de um mecanismo geral, a confirmar-se futuramente estes mesmos resultados para outros miRNAs, pode potencialmente significar que a atividade de SnRK1 é uma condição necessária para a correta acumulação de miRNAs. Para perceber se SnRK1 afeta a atividade de miRNAs, e com base em resultados preliminares do laboratório da Baena-González, procurei avaliar se SnRK1 poderia eventualmente estar a interagir com a proteína AGO1, o maior efector do complexo de silenciamento RISC. O correto reconhecimento dos miRNAs pela proteína AGO adequada e a sua subsequente incorporação no complexo RISC representa a etapa final da biogénese de miRNAs e é crítico para a sua interação com os respetivos transcritos-alvo. Em Arabidopsis, a família AGO é constituída por dez membros, mas os miRNAs são, na sua grande maioria, incorporados na AGO1. Assim, comecei por testar a interação física entre SnRK1 e AGO1 através de ensaios par-a-par de dois híbridos em levedura (“Yeast Two Hybrid” - Y2H) seguido de uma co-imunoprecipitação. Apesar de ter sido detetada uma interação positiva entre SnRK1α1 e AGO1 em levedura, através da co-imunoprecipitação não foi possível detetar interações entre as duas proteínas in planta em folhas maduras de roseta. Este resultado poderá ser talvez devido ao carácter transiente ou fraco da interação ou à sua ocorrência específica em determinados tecidos ou fases de desenvolvimento. No futuro, seria importante repetir esta experiência em tecidos ou condições em que a expressão de AGO1 seja mais elevada, eventualmente, otimizando ainda as condições da co-imunoprecipitação, para que se possa confiantemente descartar ou confirmar a ocorrência de interação física entre SnRK1 e AGO1 in planta. Paralelamente a esta abordagem bioquímica, procurei ainda perceber se existia alguma interação genética entre AGO1 e SnRK1. Para tal, mutantes ago1-27, deficientes no silenciamento pós-translacional de genes, foram cruzados com mutantes com ganho e perda de função de SnRK1α1. A interação genética foi avaliada com base na caracterização fenotípica dos processos de germinação e enverdecimento dos cotilédones na presença de elevados níveis de glucose ou ácido abscísico (ABA) e com base no tempo de floração em condições de dias longos. Relativamente à germinação e enverdecimento dos cotilédones, enquanto que, sob elevados níveis de glucose, a mutação ago1-27 parece potenciar a hipersensibilidade do sobreexpressor de SnRK1α1, sob elevadas concentrações de ABA é o sobreexpressor de SnRK1α1 que parece aumentar o fenótipo hipersensível do mutante ago1-27. Estes resultados sugerem uma possível regulação negativa de AGO1 sobre SnRK1 e vice-versa cuja intensidade e sentido podem variar consoante o tipo de stress. Curiosamente, a mutação snrk1α1-3 reverteu parcialmente o fenótipo de floração atrasado do mutante ago1-27, com o duplo mutante a florir em média dois dias antes do que as plantas ago1-27 e com menos folhas de roseta do que as plantas do tipo silvestre, reforçando ainda mais o potencial papel de AGO1 enquanto regulador negativo de SnRK1. Finalmente, para explorar a interação funcional entre SnRK1 e AGO1, desenvolvi importantes ferramentas genéticas baseadas numa linha repórter SUC::SUL que irão permitir, no futuro, testar até que ponto diferentes níveis de SnRK1 influenciam a atividade silenciadora de AGO1. No sistema repórter SUC::SUL, um RNA de cadeia dupla do gene SULPHUR, é expresso sob o controlo do promotor SUC2, específico das células de companhia do floema, dando origem a pequenos RNAs de interferência que são incorporados na AGO1, reprimindo, assim, o transcrito SUL (envolvido na biossíntese de clorofila) e causando a clorose das células silenciadas na vasculatura. Novas linhas de plantas homozigóticas para este repórter contendo diferentes mutações das subunidades catalíticas de SnRK1 foram geradas e estão prontas para ser usadas em ensaios futuros para os quais a configuração experimental foi também aqui otimizada. Em suma, os resultados apresentados nesta tese fornecem novas evidências que apontam para uma possível ação de SnRK1 em diferentes níveis de regulação sobre a via de sinalização dos miRNAs, nomeadamente na acumulação de miRNAs e na atividade de AGO1, para controlar o crescimento, desenvolvimento e respostas das plantas a stress. Estudos futuros serão necessários para confirmar a extensão e mecanismo de impacto de SnRK1 na biogénese de miRNAs e para dissecar em detalhe a interação com AGO1.
Autores principais:	Barata, Diana Reis
Assunto:	SnRK1 miRNAs AGO1 Arabidopsis thaliana Stress ambiental Teses de mestrado - 2018
Ano:	2018
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	As plantas, devido à sua incapacidade de locomoção, estão confinadas ao local onde germinaram sendo, por isso, vulneráveis a condições ambientais que restringem o seu crescimento e desenvolvimento. Temperaturas extremas, seca, inundações, elevada salinidade, exposição a metais pesados, lesões mecânicas, condições de luz inadequadas e infeção por patogéneos estão entre as maiores causas de perda de produtividade agrícola a nível mundial. Para fazer face a estas flutuações ambientais, as plantas desenvolveram, por um lado, estratégias adaptativas de sobrevivência de carácter específico, que lhes permitem responder a um tipo particular de stress e, por outro, mecanismos gerais responsáveis pelo ajuste metabólico e pela reprogramação da expressão de genes, permitindo, assim, rapidamente reparar os componentes celulares danificados e alocar nutrientes para os processos adequados, de forma a restaurar a homeostasia. Em condições normais, as plantas convertem a luz em energia química sob a forma de açúcares que são depois distribuídos pelos vários órgãos da planta permitindo o seu correto crescimento e desenvolvimento. Contudo, condições desfavoráveis com impacto deletério nos processos de fotossíntese e respiração resultam, frequentemente, na diminuição dos níveis de energia celular da planta e afetam a alocação de açúcares para os órgãos em crescimento, levando à ativação da proteína cinase SnRK1. Esta, por sua vez, para restabelecer a homeostasia, ativa processos catabólicos e inibe processos anabólicos através da fosforilação de diversas enzimas metabólicas e de uma extensa reprogramação do transcriptoma, permitindo, assim, a aclimatação e sobrevivência das plantas. A SnRK1 pertence a uma família altamente conservada de cinases e partilha semelhanças estruturais e funcionais com as proteínas ortólogas “AMP-activated protein kinase” (AMPK), nos mamíferos, e “Sucrose non-fermenting 1” (SNF1), nas leveduras, funcionando como um complexo heterotrimérico composto por uma subunidade catalítica α e duas subunidades regulatórias, β e γ. Em Arabidopsis, existem três diferentes isoformas de SnRK1α, apesar de apenas duas (codificadas pelos genes SnRK1α1/KIN10 e SnRK1α2/KIN11) serem expressas constitutivamente em todos os tecidos da planta, três diferentes isoformas de SnRK1β (codificadas pelos genes SnRK1β1, SnRK1β2 e SnRK1β3) e apenas uma isoforma da subunidade γ, SnRK1βγ. Não obstante a sua enorme importância a nível da resposta a diferentes tipos de stress, a via de sinalização da SnRK1 vai além do mero ajuste metabólico nessas condições, estando igualmente implicada na sinalização de açúcares, associada a vias de sinalização mediadas por várias hormonas vegetais e envolvida na modulação do crescimento e desenvolvimento das plantas. Contudo, apesar do seu papel central, são poucos os mecanismos descritos, até à data, capazes de explicar a reprogramação transcripcional desencadeada pela SnRK1. O aumento da expressão de determinados genes, por seu lado, é atribuído em grande parte a fatores de transcrição “basic leucine Zipper” (bZIP) bem estabelecidos enquanto efetores a jusante da via de sinalização da SnRK1. Por outro lado, quanto à repressão de genes, os mecanismos subjacentes continuam maioritariamente desconhecidos, embora os microRNAs (miRNAs) tenham sido implicados na repressão de alguns dos alvos de SnRK1, ainda que através de mecanismos desconhecidos. Os miRNAs correspondem a uma classe de pequenos RNAs endógenos não codificantes com 20-24 nucleótidos que regulam a expressão de genes pós-transcricionalmente, através da clivagem e/ou do bloqueio da tradução de transcritos complementares. Desta forma, os miRNAs têm sido extensivamente implicados tanto no crescimento e desenvolvimento das plantas como na resposta a fatores de stress biótico e abiótico. O trabalho desenvolvido nesta tese de mestrado teve como principal objetivo aumentar o conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na comunicação entre a via de sinalização de SnRK1 e os miRNAs. Para isso, foram testadas duas hipóteses não mutuamente exclusivas: a) SnRK1 afeta a biogénese de miRNAs e b) SnRK1 afeta a atividade de miRNAs. A biogénese de miRNAs ocorre no núcleo, englobando várias processos interdependentes desempenhados por componentes organizados num complexo. Em linhas gerais, a RNA Polimerase II (Pol II) é recrutada para o gene MIR, promovendo a sua transcrição e dando origem a um miRNA primário (pri-miRNA) que é processado pela proteína “DICER-like 1” (DCL1) com o auxílio das proteínas “Hyponastic-leaves 1” (HYL1) e “Serrate” (SE), originando um percursor de miRNA (pré-miRNA). Este pré-miRNA é novamente processado pela DCL1, originando uma pequena cadeia dupla formada por miRNA/miRNA, que constituem respectivamente a cadeia guia e a cadeia passageira. A extremidade 3’ do duplex miRNA/miRNA é metilada pela metil-transferase “Hua-Enhancer 1” (HEN1). Ainda no núcleo, a cadeia passageira é normalmente alvo de degradação e a cadeia guia, que constitui o miRNA maduro, é reconhecida e incorporada no complexo “RNA-induced Silencing Complex” (RISC). Este complexo tem como principal efetor uma proteína da família “ARGONAUTE” (AGO), responsável pelo reconhecimento, já no citoplasma, de transcritos-alvo com sequência complementar à do miRNA, e pela sua subsequente clivagem ou bloqueio de tradução. Problemas na biogénese de miRNAs refletem-se, normalmente, num aumento de pri-miRNAs e numa acumulação deficiente de miRNAs maduros. Deste modo, para testar a primeira hipótese, comecei por analisar a acumulação de dois miRNAs específicos – miR156 e miR319 – em plantas Arabidopsis tipo silvestre e em mutantes com perda parcial de função de SnRK1. Os resultados mostraram que a inativação parcial de SnRK1 levou à redução dos níveis de expressão de ambos os miRNAs testados. Ainda que não se consiga apurar por agora se este é um efeito específico para os miRNAs testados ou se se trata de um mecanismo geral, a confirmar-se futuramente estes mesmos resultados para outros miRNAs, pode potencialmente significar que a atividade de SnRK1 é uma condição necessária para a correta acumulação de miRNAs. Para perceber se SnRK1 afeta a atividade de miRNAs, e com base em resultados preliminares do laboratório da Baena-González, procurei avaliar se SnRK1 poderia eventualmente estar a interagir com a proteína AGO1, o maior efector do complexo de silenciamento RISC. O correto reconhecimento dos miRNAs pela proteína AGO adequada e a sua subsequente incorporação no complexo RISC representa a etapa final da biogénese de miRNAs e é crítico para a sua interação com os respetivos transcritos-alvo. Em Arabidopsis, a família AGO é constituída por dez membros, mas os miRNAs são, na sua grande maioria, incorporados na AGO1. Assim, comecei por testar a interação física entre SnRK1 e AGO1 através de ensaios par-a-par de dois híbridos em levedura (“Yeast Two Hybrid” - Y2H) seguido de uma co-imunoprecipitação. Apesar de ter sido detetada uma interação positiva entre SnRK1α1 e AGO1 em levedura, através da co-imunoprecipitação não foi possível detetar interações entre as duas proteínas in planta em folhas maduras de roseta. Este resultado poderá ser talvez devido ao carácter transiente ou fraco da interação ou à sua ocorrência específica em determinados tecidos ou fases de desenvolvimento. No futuro, seria importante repetir esta experiência em tecidos ou condições em que a expressão de AGO1 seja mais elevada, eventualmente, otimizando ainda as condições da co-imunoprecipitação, para que se possa confiantemente descartar ou confirmar a ocorrência de interação física entre SnRK1 e AGO1 in planta. Paralelamente a esta abordagem bioquímica, procurei ainda perceber se existia alguma interação genética entre AGO1 e SnRK1. Para tal, mutantes ago1-27, deficientes no silenciamento pós-translacional de genes, foram cruzados com mutantes com ganho e perda de função de SnRK1α1. A interação genética foi avaliada com base na caracterização fenotípica dos processos de germinação e enverdecimento dos cotilédones na presença de elevados níveis de glucose ou ácido abscísico (ABA) e com base no tempo de floração em condições de dias longos. Relativamente à germinação e enverdecimento dos cotilédones, enquanto que, sob elevados níveis de glucose, a mutação ago1-27 parece potenciar a hipersensibilidade do sobreexpressor de SnRK1α1, sob elevadas concentrações de ABA é o sobreexpressor de SnRK1α1 que parece aumentar o fenótipo hipersensível do mutante ago1-27. Estes resultados sugerem uma possível regulação negativa de AGO1 sobre SnRK1 e vice-versa cuja intensidade e sentido podem variar consoante o tipo de stress. Curiosamente, a mutação snrk1α1-3 reverteu parcialmente o fenótipo de floração atrasado do mutante ago1-27, com o duplo mutante a florir em média dois dias antes do que as plantas ago1-27 e com menos folhas de roseta do que as plantas do tipo silvestre, reforçando ainda mais o potencial papel de AGO1 enquanto regulador negativo de SnRK1. Finalmente, para explorar a interação funcional entre SnRK1 e AGO1, desenvolvi importantes ferramentas genéticas baseadas numa linha repórter SUC::SUL que irão permitir, no futuro, testar até que ponto diferentes níveis de SnRK1 influenciam a atividade silenciadora de AGO1. No sistema repórter SUC::SUL, um RNA de cadeia dupla do gene SULPHUR, é expresso sob o controlo do promotor SUC2, específico das células de companhia do floema, dando origem a pequenos RNAs de interferência que são incorporados na AGO1, reprimindo, assim, o transcrito SUL (envolvido na biossíntese de clorofila) e causando a clorose das células silenciadas na vasculatura. Novas linhas de plantas homozigóticas para este repórter contendo diferentes mutações das subunidades catalíticas de SnRK1 foram geradas e estão prontas para ser usadas em ensaios futuros para os quais a configuração experimental foi também aqui otimizada. Em suma, os resultados apresentados nesta tese fornecem novas evidências que apontam para uma possível ação de SnRK1 em diferentes níveis de regulação sobre a via de sinalização dos miRNAs, nomeadamente na acumulação de miRNAs e na atividade de AGO1, para controlar o crescimento, desenvolvimento e respostas das plantas a stress. Estudos futuros serão necessários para confirmar a extensão e mecanismo de impacto de SnRK1 na biogénese de miRNAs e para dissecar em detalhe a interação com AGO1.