Publicação

Anoctamins: a novel family of ion channels with extended functions and significance in disease

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana com uma prevalência de 1 em 2500-4000 nascimentos. Apresenta como sintomas característicos um declínio rápido na função pulmonar, com obstrução das vias aéreas devido à ineficaz remoção de muco e consequentes infeções bacterianas recorrentes. Estas alterações estão associadas a um ambiente de hiperinflamação, que exacerba os processos de remodelação do tecido pulmonar e acaba por culminar na fibrose dos tecidos e perda da sua função. Além deste fenótipo respiratório, os pacientes apresentam ainda insuficiência pancreática, obstrução intestinal e hepática, e elevados níveis de infertilidade masculina. Esta doença tem como causa mutações ocorridas num gene, localizado no cromossoma 7 (7q31), que codifica para uma glicoproteína com 1480 resíduos de aminoácidos, designada Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). Esta proteína tem a função de canal de cloreto (Cl-) presente na membrana apical de células epiteliais, regulando o transporte transepitelial de iões e água, quando ativada por fosforilação via proteína cinase A (PKA) dependente do cAMP. Sendo que a disrupção da função da CFTR leva a um desequilíbrio iónico do líquido que reveste as vias respiratórias, airway surface liquid (ASL), levando ao aumento de espessura e viscosidade do muco provocados pela sua desidratação. A deleção de um único aminoácido, uma fenilalanina na posição 508 (F508del) está presente em aproximadamente 90% dos pacientes com FQ, sendo a mais comum de entre as mais de 1949 conhecidas. Esta mutação afeta o correto processamento da proteína que, devido a um folding incorreto, fica retida intracelularmente a nível do retículo endoplasmático (RE) onde é rapidamente enviada para a via de degradação proteolítica do proteassoma associada ao RE, não chegando assim à membrana plasmática. A função fisiológica da CFTR no epitélio vai para além do seu papel como canal de Cl-, existindo várias evidências da sua atuação como proteína reguladora de outros canais iónicos relevantes na patofisiologia da FQ. Entre eles encontram-se o canal de sódio epitelial (ENaC) e canais de potássio como KVLQT-1. Outros canais que possivelmente interatuam com a CFTR são os canais de cloreto ativados por cálcio (CaCC) e outwardly rectifying (ORCC). Os primeiros têm a função de transporte iónico transepitelial em células secretoras e são caracterizados por apresentarem uma ativação dependente da subida dos níveis de Ca2+ intracelular. Por sua vez, os ORCC distinguem-se por demonstrarem uma relação I/V outwardly rectifying e serem ativados por despolarização celular e via PKA e UTP extracelular. A produção de corrente pelos CaCCs encontra-se aumentada nas vias respiratórias de doentes com fibrose quística, provavelmente para tentar compensar de algum modo a ineficácia da CFTR. Enquanto que a ativação dos ORCC pela PKA encontra-se afetada nos tecidos de doentes com fibrose quística. A relação da CFTR com estes canais tornou-se ainda mais interessante quando, em 2008, estes foram molecularmente identificados como Anoctaminas, uma família de dez proteínas que apresenta semelhança estrutural, com oito segmentos transmembranares e um poro entre os segmentos 5 e 6, mas diferenças em termos funcionais. A Anoctamina 1 é reconhecida como o grande componente dos CaCCs, enquanto que a Anoctamina 6 atua como ORCC. O trabalho elaborado teve como objetivo explorar esta relação entre a CFTR e as Anoctaminas (mais especificamente Ano1 e Ano6). Foi estudado o tipo de interação existente entre ambas as proteínas (física ou só funcional) e o impacto que a presença da CFTR-WT ou CFTR-F508del teria na expressão, localização celular e função da Ano1 e Ano6. Nunca esquecendo o grande potencial desta nova família de proteínas como alvo farmacológico alternativo para a terapêutica da fibrose quística. Inicialmente estudou-se a expressão endógena das anoctaminas (Ano1, 6, 9 e 10) nas células CFBE, estavelmente transfectadas com CFTR-WT ou F508del, através da técnica de PCR semi-quantitativo. De seguida, em células BHK, foi estudada a potencial influência da CFTR-WT e F508del na localização celular da Ano1 e 6, usando técnicas de microscopia. Foram também realizados ensaios de co-imunoprecipitação com o objetivo de compreender se a interação entre a CFTR e a Ano1 ou 6 seria física/direta e não só funcional. Finalmente, investigou-se o impacto da CFTR-WT e F508del na funcionalidade das anoctaminas Ano1 e 6 através de técnicas de patch clamp. Os resultados obtidos sugerem que: - Em células CFBE, a Ano6 é a Anoctamina mais expressa de entre a Ano1, 6, 9 e 10 e que estas células não apresentam expressão endógena de Ano10; - A Ano1 e 6 são significativamente mais expressas em células CFBE expressando estavelmente CFTR-WT, os níveis de mRNA da Ano9 são bastante mais elevados nas células que expressam a forma WT, mas não estatisticamente diferentes dos níveis detetados nas CFBE CFTR-F508del; - Tanto em BHK CFTR-WT como em CFTR-F508del, a Ano1 localiza-se maioritariamente na membrana plasmática. Contudo, os níveis de expressão membranar são significativamente maiores nas células que expressam CFTR-WT; - A Ano6 encontra-se não só localizada na membrana plasmática como também intracelularmente; - Tanto a Ano1 como a Ano6 apresentam uma interação direta com a CFTR-WT. No entanto, tal não acontece quando a CFTR-F508del é expressa; - A interação entre a CFTR e a Ano1 não se efetua através de proteínas de ancoragem ao domínio PDZ; - A Ano1 encontra-se constitutivamente ativa quando transientemente expressa em células BHK que expressam estavelmente CFTR-WT ou F508del; - A Ano1 parece inibir a ativação das correntes produzidas pela CFTR-WT; - As experiências funcionais corroboram a ausência de interação direta entre Ano1 e CFTR através do domínio de ligação PDZ.
Autores principais:	Afonso, Sara Cerqueira
Assunto:	Bioquímica Teses de mestrado - 2013
Ano:	2013
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana com uma prevalência de 1 em 2500-4000 nascimentos. Apresenta como sintomas característicos um declínio rápido na função pulmonar, com obstrução das vias aéreas devido à ineficaz remoção de muco e consequentes infeções bacterianas recorrentes. Estas alterações estão associadas a um ambiente de hiperinflamação, que exacerba os processos de remodelação do tecido pulmonar e acaba por culminar na fibrose dos tecidos e perda da sua função. Além deste fenótipo respiratório, os pacientes apresentam ainda insuficiência pancreática, obstrução intestinal e hepática, e elevados níveis de infertilidade masculina. Esta doença tem como causa mutações ocorridas num gene, localizado no cromossoma 7 (7q31), que codifica para uma glicoproteína com 1480 resíduos de aminoácidos, designada Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). Esta proteína tem a função de canal de cloreto (Cl-) presente na membrana apical de células epiteliais, regulando o transporte transepitelial de iões e água, quando ativada por fosforilação via proteína cinase A (PKA) dependente do cAMP. Sendo que a disrupção da função da CFTR leva a um desequilíbrio iónico do líquido que reveste as vias respiratórias, airway surface liquid (ASL), levando ao aumento de espessura e viscosidade do muco provocados pela sua desidratação. A deleção de um único aminoácido, uma fenilalanina na posição 508 (F508del) está presente em aproximadamente 90% dos pacientes com FQ, sendo a mais comum de entre as mais de 1949 conhecidas. Esta mutação afeta o correto processamento da proteína que, devido a um folding incorreto, fica retida intracelularmente a nível do retículo endoplasmático (RE) onde é rapidamente enviada para a via de degradação proteolítica do proteassoma associada ao RE, não chegando assim à membrana plasmática. A função fisiológica da CFTR no epitélio vai para além do seu papel como canal de Cl-, existindo várias evidências da sua atuação como proteína reguladora de outros canais iónicos relevantes na patofisiologia da FQ. Entre eles encontram-se o canal de sódio epitelial (ENaC) e canais de potássio como KVLQT-1. Outros canais que possivelmente interatuam com a CFTR são os canais de cloreto ativados por cálcio (CaCC) e outwardly rectifying (ORCC). Os primeiros têm a função de transporte iónico transepitelial em células secretoras e são caracterizados por apresentarem uma ativação dependente da subida dos níveis de Ca2+ intracelular. Por sua vez, os ORCC distinguem-se por demonstrarem uma relação I/V outwardly rectifying e serem ativados por despolarização celular e via PKA e UTP extracelular. A produção de corrente pelos CaCCs encontra-se aumentada nas vias respiratórias de doentes com fibrose quística, provavelmente para tentar compensar de algum modo a ineficácia da CFTR. Enquanto que a ativação dos ORCC pela PKA encontra-se afetada nos tecidos de doentes com fibrose quística. A relação da CFTR com estes canais tornou-se ainda mais interessante quando, em 2008, estes foram molecularmente identificados como Anoctaminas, uma família de dez proteínas que apresenta semelhança estrutural, com oito segmentos transmembranares e um poro entre os segmentos 5 e 6, mas diferenças em termos funcionais. A Anoctamina 1 é reconhecida como o grande componente dos CaCCs, enquanto que a Anoctamina 6 atua como ORCC. O trabalho elaborado teve como objetivo explorar esta relação entre a CFTR e as Anoctaminas (mais especificamente Ano1 e Ano6). Foi estudado o tipo de interação existente entre ambas as proteínas (física ou só funcional) e o impacto que a presença da CFTR-WT ou CFTR-F508del teria na expressão, localização celular e função da Ano1 e Ano6. Nunca esquecendo o grande potencial desta nova família de proteínas como alvo farmacológico alternativo para a terapêutica da fibrose quística. Inicialmente estudou-se a expressão endógena das anoctaminas (Ano1, 6, 9 e 10) nas células CFBE, estavelmente transfectadas com CFTR-WT ou F508del, através da técnica de PCR semi-quantitativo. De seguida, em células BHK, foi estudada a potencial influência da CFTR-WT e F508del na localização celular da Ano1 e 6, usando técnicas de microscopia. Foram também realizados ensaios de co-imunoprecipitação com o objetivo de compreender se a interação entre a CFTR e a Ano1 ou 6 seria física/direta e não só funcional. Finalmente, investigou-se o impacto da CFTR-WT e F508del na funcionalidade das anoctaminas Ano1 e 6 através de técnicas de patch clamp. Os resultados obtidos sugerem que: - Em células CFBE, a Ano6 é a Anoctamina mais expressa de entre a Ano1, 6, 9 e 10 e que estas células não apresentam expressão endógena de Ano10; - A Ano1 e 6 são significativamente mais expressas em células CFBE expressando estavelmente CFTR-WT, os níveis de mRNA da Ano9 são bastante mais elevados nas células que expressam a forma WT, mas não estatisticamente diferentes dos níveis detetados nas CFBE CFTR-F508del; - Tanto em BHK CFTR-WT como em CFTR-F508del, a Ano1 localiza-se maioritariamente na membrana plasmática. Contudo, os níveis de expressão membranar são significativamente maiores nas células que expressam CFTR-WT; - A Ano6 encontra-se não só localizada na membrana plasmática como também intracelularmente; - Tanto a Ano1 como a Ano6 apresentam uma interação direta com a CFTR-WT. No entanto, tal não acontece quando a CFTR-F508del é expressa; - A interação entre a CFTR e a Ano1 não se efetua através de proteínas de ancoragem ao domínio PDZ; - A Ano1 encontra-se constitutivamente ativa quando transientemente expressa em células BHK que expressam estavelmente CFTR-WT ou F508del; - A Ano1 parece inibir a ativação das correntes produzidas pela CFTR-WT; - As experiências funcionais corroboram a ausência de interação direta entre Ano1 e CFTR através do domínio de ligação PDZ.