Publicação

The aroma of portuguese wine grapes: impact of infection with Botrytis cinerea

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As uvas são das frutas mais produzidas e comercializadas em Portugal. À escala mundial é um dos frutos mais importantes a nível económico. As uvas que provêm de castas de videira diferentes apresentam características próprias como por exemplo, a cor e o seu aroma (que é constituído por determinadas concentrações de compostos específicos). A Trincadeira é uma das castas mais produzidas em Portugal originando uvas que, mais tarde, podem produzir excelentes vinhos. No entanto, as videiras são suscetíveis a vários agentes patogénicos, sendo a Trincadeira muito sensível ao fungo Botrytis cinerea. Este fungo reduz drasticamente a colheita destruindo parcial ou completamente os cachos de uvas, alterando a sua qualidade e características biológicas. Ao alterar a qualidade das uvas, o seu aroma também sofre várias modificações. Deste modo, o conjunto de compostos voláteis libertados para a atmosfera correspondentes ao aroma vão ser diferentes do que é considerado adequado, prejudicando a produção do vinho feita a partir destas uvas. Esta tese de mestrado tem como objetivo dar a conhecer as mudanças que ocorrem no aroma das uvas da Trincadeira quando infetada pela Botrytis cinerea, que degrada todos os tecidos das uvas. Neste estudo foram utilizadas uvas no seu último estádio de desenvolvimento EL38, também denominado por estádio de colheita. O estudo visa a caracterização dos compostos voláteis livres e glicosilados responsáveis pelo aroma da uva Trincadeira, com e sem a infeção do fungo B. cinerea, e ainda apurar a quantidade de fenóis e antocianinas. Os genes (enzimas) responsáveis pela síntese dos voláteis livres e glicosilados também foram analisados de modo a verificar quais os que obtiveram uma maior modificação e nível de expressão, devido à infeção. A análise dos voláteis foi feita a partir da técnica Headspace solid-phase microextraction (HP-SPME) onde o sumo da uva foi aquecido em banho maria, os voláteis libertados e absorvidos para serem de seguida identificados por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC- MS). Inicialmente foram determinados os voláteis livres e, só após esta análise se determinou os glicosilados com a adição da enzima β-glycosidase. Com base nos resultados deste estudo identificaram-se vários possíveis marcadores da infeção que surgiram face à presença do fungo Botrytis cinerea e também, por parte do aceleramento da maturação do sumo de uva pela enzima β-glycosidase. Com base nestes voláteis identificados na Trincadeira e na bibliografia, selecionaram-se os vários genes que codificam para enzimas envolvidas na síntese de compostos voláteis específicos. Deste modo, procedeu-se à análise da expressão dos genes responsáveis pela origem do aroma por PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) para verificar se estes apresentavam um maior ou menor nível de expressão, em relação ao efeito produzido pelo fungo na sua síntese. No final, apenas os genes referentes aos voláteis livres, hydroperoxide lyase 2 (HPL2) e lipoxygenase C (LOXC) apresentaram um maior nível de expressão quando as uvas se encontravam infetadas. A expressão dos genes referentes aos voláteis glicosilados, glutathione synthetase 21 (GS21) e O-methyltransferase 1 (OMT1) também aumentaram ligeiramente nas uvas infetadas. Esta informação sugere que a infeção com o fungo B. cinerea modifica a expressão destes genes. O HPL2 é expresso quando a uva sofre danos no tecido vegetal ou fica sujeito a stress tanto abiótico como biótico, uma vez que este gene regula o reconhecimento e a resistência tanto a insetos como a agentes patogénicos para mais tarde os eliminar. Com a infeção da Botrytis o HPL2 aumenta a sua expressão na uva infectada. Em relação à enzima LOXC, sabe-se que é responsável pela produção de aldeídos e álcoois e o seu nível de expressão, por norma, decresce no último estádio de maturação da uva (harvest stage). No entanto, durante a infeção a sua expressão aumenta. A enzima GS21 é responsável pelo metabolismo dos aminoácidos e tem como função, prevenir a perda do aroma e o aparecimento de manchas castanhas na pele da uva. Face aos resultados, o nível de expressão nas uvas infetadas e nos controlos é muito semelhante, não se conseguindo obter resultados conclusivos. Eventualmente as alterações a nível de expressão fizeram-se sentir previamente, sendo agora mais presente uma actividade enzimática diferente entre uvas infectadas e controlo. A enzima OMT1 assegura o crescimento e desenvolvimento das uvas assim como do seu aroma. Os resultados desta tese demonstraram existir o aumento do seu nível de expressão após a infeção nas uvas Trincadeira, mas não foi significativo. No futuro, é fundamental voltar a repetir a análise aos voláteis e a estes genes, a partir de mais amostras (réplicas biológicas) e validar esta informação com outras estações produtivas para identificar marcadores metabólicos robustos. Outros genes/enzimas relacionados com o aroma e não estudados neste trabalho, também poderão ser analisados e assim complementar este perfil, inclusive através da análise de bagos menos maduros. Os fenóis e antocianinas foram quantificados para confirmar mais uma vez, as mudanças que surgem nas uvas devido à infeção pela B. cinerea. Para a determinação dos fenóis e antocianinas recorreu-se à liofilização das uvas e à sua quantificação por absorvância no espectrofotômetro após a sua extração por diferentes métodos. Estes compostos são fundamentais para a produção do aroma e para a proteção da uva, através de uma barreira na sua pele criando inibidores de fungos que asseguram a qualidade das uvas e do vinho. Por norma, estes compostos defendem a uva contra o agente patogénico, mas, com uma grande infeção da B. cinerea nas uvas estas perdem a sua capacidade de defesa e ficando muito suscetíveis. Assim, verifica-se uma diminuição gradual destes compostos, no último estágio de desenvolvimento das uvas. Os resultados apresentados neste estudo demonstram essa mesma diminuição, facto confirmado em outras investigações. Um estudo exploratório, para além do proposto inicialmente na tese, foi executado de modo a analisar os fenóis e antocianinas presentes nas uvas com e sem a hormona melatonina. Recentemente descobriu-se o papel desta hormona na proteção das plantas, contra danos, stress abiótico e biótico ou agentes patogénicos como o fungo B. cinerea. Ao tratar as uvas com melatonina promovemos a sua maturação e qualidade. Este estudo teve como objetivo determinar se a hormona adicionada exogenamente iria proporcionar alguma das características atrás referidas. Infelizmente, nos testes realizados nas uvas da Trincadeira e Touriga Nacional não se verificaram mudanças significativas ao nível da qauntificação dos fenóis e antocianinas que permitissem obter resultados pertinentes, sabendo-se ainda muito pouco acerca do papel da melatonina no último estágio de desenvolvimento das uvas. Como conclusão, este trabalho permitiu identificar os compostos voláteis pertencentes ao aroma do sumo de uva da casta Trincadeira do ano 2018, com e sem infeção do fungo B. cinerea. A partir desta informação é possível identificar as mudanças que ocorrem no aroma da uva e determinar o perfil de compostos voláteis característicos da Botrytis cinerea na Trincadeira. A expressão de alguns genes envolvidos no aroma sofreram alterações putativas envolvidas no aroma final das uvas da Trincadeira com e sem a presença do fungo. Estes dados englobam um conjunto de informação necessária para determinar e completar os dados anteriores referentes ao perfil dos compostos voláteis sobre o aroma das uvas com e sem a infeção da Botrytis cinerea. A determinação dos fenóis e antocianinas permitiu verificar mais uma vez a infeção e a gravidade que o fungo Botrytis cinerea produz nas vinhas. Os resultados deste estudo poderão vir a ter impacto na decisão sobre a melhor forma de controlar ou minimizar a proliferação nas uvas, por parte deste agente patogénico. Poderá ainda vir a ser do interesse de alguns produtores vinícolas no que respeita às mudanças que ocorrem no aroma e qualidade das uvas após a infeção.
Autores principais:	Augusto, Catarina da Silva
Assunto:	Trincadeira Botrytis cinerea Compostos voláteis Compostos fenólicos Genes do aroma Teses de mestrado - 2019
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	As uvas são das frutas mais produzidas e comercializadas em Portugal. À escala mundial é um dos frutos mais importantes a nível económico. As uvas que provêm de castas de videira diferentes apresentam características próprias como por exemplo, a cor e o seu aroma (que é constituído por determinadas concentrações de compostos específicos). A Trincadeira é uma das castas mais produzidas em Portugal originando uvas que, mais tarde, podem produzir excelentes vinhos. No entanto, as videiras são suscetíveis a vários agentes patogénicos, sendo a Trincadeira muito sensível ao fungo Botrytis cinerea. Este fungo reduz drasticamente a colheita destruindo parcial ou completamente os cachos de uvas, alterando a sua qualidade e características biológicas. Ao alterar a qualidade das uvas, o seu aroma também sofre várias modificações. Deste modo, o conjunto de compostos voláteis libertados para a atmosfera correspondentes ao aroma vão ser diferentes do que é considerado adequado, prejudicando a produção do vinho feita a partir destas uvas. Esta tese de mestrado tem como objetivo dar a conhecer as mudanças que ocorrem no aroma das uvas da Trincadeira quando infetada pela Botrytis cinerea, que degrada todos os tecidos das uvas. Neste estudo foram utilizadas uvas no seu último estádio de desenvolvimento EL38, também denominado por estádio de colheita. O estudo visa a caracterização dos compostos voláteis livres e glicosilados responsáveis pelo aroma da uva Trincadeira, com e sem a infeção do fungo B. cinerea, e ainda apurar a quantidade de fenóis e antocianinas. Os genes (enzimas) responsáveis pela síntese dos voláteis livres e glicosilados também foram analisados de modo a verificar quais os que obtiveram uma maior modificação e nível de expressão, devido à infeção. A análise dos voláteis foi feita a partir da técnica Headspace solid-phase microextraction (HP-SPME) onde o sumo da uva foi aquecido em banho maria, os voláteis libertados e absorvidos para serem de seguida identificados por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC- MS). Inicialmente foram determinados os voláteis livres e, só após esta análise se determinou os glicosilados com a adição da enzima β-glycosidase. Com base nos resultados deste estudo identificaram-se vários possíveis marcadores da infeção que surgiram face à presença do fungo Botrytis cinerea e também, por parte do aceleramento da maturação do sumo de uva pela enzima β-glycosidase. Com base nestes voláteis identificados na Trincadeira e na bibliografia, selecionaram-se os vários genes que codificam para enzimas envolvidas na síntese de compostos voláteis específicos. Deste modo, procedeu-se à análise da expressão dos genes responsáveis pela origem do aroma por PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) para verificar se estes apresentavam um maior ou menor nível de expressão, em relação ao efeito produzido pelo fungo na sua síntese. No final, apenas os genes referentes aos voláteis livres, hydroperoxide lyase 2 (HPL2) e lipoxygenase C (LOXC) apresentaram um maior nível de expressão quando as uvas se encontravam infetadas. A expressão dos genes referentes aos voláteis glicosilados, glutathione synthetase 21 (GS21) e O-methyltransferase 1 (OMT1) também aumentaram ligeiramente nas uvas infetadas. Esta informação sugere que a infeção com o fungo B. cinerea modifica a expressão destes genes. O HPL2 é expresso quando a uva sofre danos no tecido vegetal ou fica sujeito a stress tanto abiótico como biótico, uma vez que este gene regula o reconhecimento e a resistência tanto a insetos como a agentes patogénicos para mais tarde os eliminar. Com a infeção da Botrytis o HPL2 aumenta a sua expressão na uva infectada. Em relação à enzima LOXC, sabe-se que é responsável pela produção de aldeídos e álcoois e o seu nível de expressão, por norma, decresce no último estádio de maturação da uva (harvest stage). No entanto, durante a infeção a sua expressão aumenta. A enzima GS21 é responsável pelo metabolismo dos aminoácidos e tem como função, prevenir a perda do aroma e o aparecimento de manchas castanhas na pele da uva. Face aos resultados, o nível de expressão nas uvas infetadas e nos controlos é muito semelhante, não se conseguindo obter resultados conclusivos. Eventualmente as alterações a nível de expressão fizeram-se sentir previamente, sendo agora mais presente uma actividade enzimática diferente entre uvas infectadas e controlo. A enzima OMT1 assegura o crescimento e desenvolvimento das uvas assim como do seu aroma. Os resultados desta tese demonstraram existir o aumento do seu nível de expressão após a infeção nas uvas Trincadeira, mas não foi significativo. No futuro, é fundamental voltar a repetir a análise aos voláteis e a estes genes, a partir de mais amostras (réplicas biológicas) e validar esta informação com outras estações produtivas para identificar marcadores metabólicos robustos. Outros genes/enzimas relacionados com o aroma e não estudados neste trabalho, também poderão ser analisados e assim complementar este perfil, inclusive através da análise de bagos menos maduros. Os fenóis e antocianinas foram quantificados para confirmar mais uma vez, as mudanças que surgem nas uvas devido à infeção pela B. cinerea. Para a determinação dos fenóis e antocianinas recorreu-se à liofilização das uvas e à sua quantificação por absorvância no espectrofotômetro após a sua extração por diferentes métodos. Estes compostos são fundamentais para a produção do aroma e para a proteção da uva, através de uma barreira na sua pele criando inibidores de fungos que asseguram a qualidade das uvas e do vinho. Por norma, estes compostos defendem a uva contra o agente patogénico, mas, com uma grande infeção da B. cinerea nas uvas estas perdem a sua capacidade de defesa e ficando muito suscetíveis. Assim, verifica-se uma diminuição gradual destes compostos, no último estágio de desenvolvimento das uvas. Os resultados apresentados neste estudo demonstram essa mesma diminuição, facto confirmado em outras investigações. Um estudo exploratório, para além do proposto inicialmente na tese, foi executado de modo a analisar os fenóis e antocianinas presentes nas uvas com e sem a hormona melatonina. Recentemente descobriu-se o papel desta hormona na proteção das plantas, contra danos, stress abiótico e biótico ou agentes patogénicos como o fungo B. cinerea. Ao tratar as uvas com melatonina promovemos a sua maturação e qualidade. Este estudo teve como objetivo determinar se a hormona adicionada exogenamente iria proporcionar alguma das características atrás referidas. Infelizmente, nos testes realizados nas uvas da Trincadeira e Touriga Nacional não se verificaram mudanças significativas ao nível da qauntificação dos fenóis e antocianinas que permitissem obter resultados pertinentes, sabendo-se ainda muito pouco acerca do papel da melatonina no último estágio de desenvolvimento das uvas. Como conclusão, este trabalho permitiu identificar os compostos voláteis pertencentes ao aroma do sumo de uva da casta Trincadeira do ano 2018, com e sem infeção do fungo B. cinerea. A partir desta informação é possível identificar as mudanças que ocorrem no aroma da uva e determinar o perfil de compostos voláteis característicos da Botrytis cinerea na Trincadeira. A expressão de alguns genes envolvidos no aroma sofreram alterações putativas envolvidas no aroma final das uvas da Trincadeira com e sem a presença do fungo. Estes dados englobam um conjunto de informação necessária para determinar e completar os dados anteriores referentes ao perfil dos compostos voláteis sobre o aroma das uvas com e sem a infeção da Botrytis cinerea. A determinação dos fenóis e antocianinas permitiu verificar mais uma vez a infeção e a gravidade que o fungo Botrytis cinerea produz nas vinhas. Os resultados deste estudo poderão vir a ter impacto na decisão sobre a melhor forma de controlar ou minimizar a proliferação nas uvas, por parte deste agente patogénico. Poderá ainda vir a ser do interesse de alguns produtores vinícolas no que respeita às mudanças que ocorrem no aroma e qualidade das uvas após a infeção.