Publicação

Exploring the role of the Jumonji/ARID1 family of proteins during embryonic stem cell differentiation and X-chromosome inactivation

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A inactivação do cromossoma X (XCI) ocorre nas fêmeas de mamífero e serve para compensar o desiquilíbrio do número de genes expressos, entre fêmeas que contem dois cromosomas X e machos que contêm apenas um X e um cromosoma Y (com aproximadamente 10x menos genes). Este processo de silenciamento é um dos exemplos mais dramáticos de fenómenos epigenéticos em mamíferos. Em ratinho, XCI ocorre em duas fases durante o desenvolvimento: inactivação do cromosoma X paterno (a que se chama “imprinting”) no embrião durante a fase depre-implantação e nos tecidos extraembrionários; no estado de blastocisto nas células que darão origem ao embrião ocorre a reactivação do X paterno inicialmente, seguido de uma escolha aleatória entre os dois cromosomas X a ser inactivado [Takagi; 1975] [Okamoto; 2004]. Vários estudos mostraram que o processo de XCI pode ser espontaneamente racapitulado em células estaminais embrionárias (ESC) de ratinho. Estas possuem ambos os cromossomas X activos e, quando sujeitas a diferenciação, um dos X torna-se inactivo [Heard; 2006]. XCI é iniciada com o aumento da expressão, no Xi, de um RNA não codificante – Xist – que se espalha ao longo do cromossoma (em cis) formando um domínio silenciador. RNA PolII é excluida e algumas modificações pos-transcripcionais nas caudas amino-terminais das histons, que são características da eucromatina são perdidas, como H3K4me2/me3 e acetilação das histonas H3 e H4. De seguida, são recrutados complexos repressivos (PRC1 e PRC2) e depositadas marcas de repressão, tais como H3K27me3, H3K9me2, HAK20me1 e H2Aub. Eventos mais tardios, como o recrutamento de macroH2A e a metilação do DNA nos promotores dos genes do cromosoma X, contribuem para a manutenção do estado inactivo do Xi [Chow; 2009] (Fig.1). Apesar de muitos avanços terem sido feitos no estudo da XCI, os mecanismos exactos para o silenciamento génico permanecem por explicar. Neste trabalho, tentámos explorar as alterações dos estados de metilação da histona 3 lisina 4 e metilação de H3K27me3 no contexto de XCI. A perda de metilação na H3K4 é um dos primeiros eventos a ocorrer na XCI. Apesar do mecanismo molecular envolvido nestas alterações ser desconhecido, a rápida perda de H3K4me2/3 sugere o envolvimento de demetilases que removem estas marcas. Proteinas da família Jumonji/ARID1 – JARID1A, JARID1B e JARID1C – foram já identificadas como demetilases específicas para H3K4me2/3 [Christensen; 2007]. Devido à sua estrutura proteica e ao facto de desempenharem funções essenciais no desenvolvimento e controlo da divisão celular, são consideradas boas candidatas para o papel de demetilases de H3K4 no processo de XCI. Contrariamente a H3K4me2/3, H3K27me3 é uma modificação pós-transcripcional repressiva da cauda amino-terminal da histone H3. H3K27me3 é depositada na histona H3 pelo complexo PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) e reconhecida pelo complexo PRC1, que promove a ubiquitinação de H2AK119 e consequente condensação da cromatina [Kingston; 2010]. Ambos os complexos repressivos PRC1/2 estão presentes no cromossoma Xi. No entanto, o mecanismo pelo qual são recrutados está ainda por esclarecer (Silva et al., 2003). Recentemente, 5 estudos independentes identificaram a proteina JARID2 - da família Jumonji/ARID1 - como parte do complexo PRC2 [Shen; 2009] [Peng; 2009] [Pasini; 2010] [Li; 2010] [Landeira; 2010]. No entanto, estudos funcionais geraram resultados bastante conflituosos relativamente ao papel do JARID2 na actividade de metiltransferase de PRC2 e na regulação dos níveis de H3K27me3 nos genes alvo. Devido à sua associação com PRC2, e possível interação com PRC1 [Eberl, resultados não publicados], JARID2 potencialmente poderá ter um papel chave no recrutamento destes complexos para o cromossoma X durante XCI." Para explorar o papel destas proteinas, da família Jumonji/ARID1, durante a diferenciação e no contexto da XCI, transfectámos ESC femininas com BACs contendo um dos quatro genes com GFP fundido na extremidade carboxil (JARID1A/B/C e JARID2). Foram obtidas ESC transgénicas para todos eles excepto JARID1A, devido a um erro na inserção da GFP motivado pela incorrecta anotação do gene. Este poderoso sistema, juntamente com técnicas avançadas de microscopia, permitiu-nos localizar proteinas em ESC e descrever a sua cinética durante a diferenciação e XCI. Explorar o papel das demetilases de H3K4 na biologia das ESC e na XCI A análise dos padrões de expressão de JARID1B e JARID1C em ESC (não diferenciadas) condosiu-nos a um resultado bastante interessante. Em ESC, JARID1B-GFP (e JARID1B endógeno) e JARID1C-GFP apresentam uma expressão heterogénia. Curiosamente, a expressão de JARID1B, mas não a de JARID1C, está correlacionada negativamente com os níveis de H3K4me2/3 na célula. Células que expressam muito JARID1B apresentam baixos níveis de H3K4me2/3 e vice-versa. Estes dados sugerem que os níveis de expressão de JARID1B determinam os níveis globais de H3K4me2/3 em ESC. Estudos funcionais, tais como knock down (KD) ou knock out (KO) (trabalho em colaboração) e sobre-expressão de JARID1B (através dos clones JARID1BGFP) podem ser realizados para tentar explorar o impacto de JARID1 e dos níveis de metilação de H3K4 em ESC. Na tentativa de perceber a razão para este mosaicismo, testamos a hipótese da expressão de JARID1B estar correlacionada com o ciclo celular ou ser dependente de factores de pluripotência, como NANOG e OCT4. Os resultados preliminares obtidos (live cell imaging e imunoflorescência) não suportam nenhuma destas hipóteses. A possibilidade da variação na expressão de JARID1B ser estocástica numa população de ESC é, para nós, a mais aceite [Roesch; 2010]. De seguida fomos investigar se JARID1B-GFP e JARID1C-GFP são recrutados para o cromossoma X, durante XCI. Os nossos resultados mostraram que estas proteinas não são recrutadas para o Xi e são perdidas com uma dinâmica semelhante à perda de H3K4me2 , quando analisado por técnicas de IF/RNA FISH. No entanto, o seu papel na demetilação de H3K4 durante a XCI não pode ser para já excluido, pois a sua associação com a cromatina pode ser apenas transiente ou decorrer noutra altura do processo de inactivação. Técnicas como ChIP e ChIP-seq nos clones GFP-tagged permitir-nos-ão verificar com mais precisão se estas proteinas interactuam com alguma região do cromossoma X. Explorar o papel de JARID2 na metilação de H3K27 durante a XCI Neste trabalho, observamos pela primeira vez JARID2 ser recrutado para o Xi, durante o processo de XCI. O recrutamento tem início no 1º dia de diferenciação, é máximo no 2º dia e diminui ao 4º e 6º dias. Para perceber se JARID2 está envolvido nas funções dos complexos repressivos PRC1 e PRC2 durante a XCI, foi feita uma análise comparativa das suas cinéticas de recrutamento para o Xi. A nossa análise mostrou que JARID2 e EED (membro do PRC2) estão presentes aproximadamente no mesmo número de domínios, enquanto que RING1B (membro do PRC1) é observado apenas numa pequena fracção dos domínios. No entanto, uma análise mais detalhada em que observamos JARID2 e EED simultaneamente, mostra que a cinética de recrutamento destas duas proteinas é diferente. JARID2 atinge o seu nível máximo no 2º dia de diferenciação e decresce ao 4º dia, enquanto que EED não atinge um nível tão elevado ao 2º dia e permanece inalterado ao 4º dia. Outro resultado bastante interessante é o facto dos níveis de H3K27me3 aumentarem quando JARID2 diminui e PRC2 se mantem no Xi. Estes resultados apoiam em parte um modelo proposto no artigo [Peng; 2009]: JARID2 após ser recrutado para o Xi, possivelmente por ligação ao Xist RNA, iria promover a ligação de PRC2. Este, em complexo com JARID2, teria a sua actividade enzimática inibida e só se tornaria totalmente funcional (na trimetilação de H3K27) quando JARID2 é perdido do Xi. Estudos funcionais, com o objectivo de explorar a possível interdependência entre JARID2 e PRC2 no processo, já começaram a ser desenvolvidos com a criação de ESC KD para Jarid2 e ESC KD para Suz12 (membro do PRC2). Neste trabalho os BACs alterados com a inserção de GFP foram utilizados em experiências de localização de proteinas em celulas fixas e vivas. Além disto, as linhas celulares com BACGFP podem ser utilizadas para estudos de espectometria de massa para identificar complexos proteicos em que estão envolvidos e também para ChIP ou ChIP-seq para identificar os genes alvo destas proteinas [Poser; 2008]. Isto permitirá comprender melhor as funções destas proteinas em ESC e também na XCI se tiverem uma função nesse processo.
Autores principais:	Matias, Neuza Maria Reis, 1987-
Assunto:	Biologia molecular Proteínas Células estaminais embrionárias Teses de mestrado - 2010
Ano:	2010
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A inactivação do cromossoma X (XCI) ocorre nas fêmeas de mamífero e serve para compensar o desiquilíbrio do número de genes expressos, entre fêmeas que contem dois cromosomas X e machos que contêm apenas um X e um cromosoma Y (com aproximadamente 10x menos genes). Este processo de silenciamento é um dos exemplos mais dramáticos de fenómenos epigenéticos em mamíferos. Em ratinho, XCI ocorre em duas fases durante o desenvolvimento: inactivação do cromosoma X paterno (a que se chama “imprinting”) no embrião durante a fase depre-implantação e nos tecidos extraembrionários; no estado de blastocisto nas células que darão origem ao embrião ocorre a reactivação do X paterno inicialmente, seguido de uma escolha aleatória entre os dois cromosomas X a ser inactivado [Takagi; 1975] [Okamoto; 2004]. Vários estudos mostraram que o processo de XCI pode ser espontaneamente racapitulado em células estaminais embrionárias (ESC) de ratinho. Estas possuem ambos os cromossomas X activos e, quando sujeitas a diferenciação, um dos X torna-se inactivo [Heard; 2006]. XCI é iniciada com o aumento da expressão, no Xi, de um RNA não codificante – Xist – que se espalha ao longo do cromossoma (em cis) formando um domínio silenciador. RNA PolII é excluida e algumas modificações pos-transcripcionais nas caudas amino-terminais das histons, que são características da eucromatina são perdidas, como H3K4me2/me3 e acetilação das histonas H3 e H4. De seguida, são recrutados complexos repressivos (PRC1 e PRC2) e depositadas marcas de repressão, tais como H3K27me3, H3K9me2, HAK20me1 e H2Aub. Eventos mais tardios, como o recrutamento de macroH2A e a metilação do DNA nos promotores dos genes do cromosoma X, contribuem para a manutenção do estado inactivo do Xi [Chow; 2009] (Fig.1). Apesar de muitos avanços terem sido feitos no estudo da XCI, os mecanismos exactos para o silenciamento génico permanecem por explicar. Neste trabalho, tentámos explorar as alterações dos estados de metilação da histona 3 lisina 4 e metilação de H3K27me3 no contexto de XCI. A perda de metilação na H3K4 é um dos primeiros eventos a ocorrer na XCI. Apesar do mecanismo molecular envolvido nestas alterações ser desconhecido, a rápida perda de H3K4me2/3 sugere o envolvimento de demetilases que removem estas marcas. Proteinas da família Jumonji/ARID1 – JARID1A, JARID1B e JARID1C – foram já identificadas como demetilases específicas para H3K4me2/3 [Christensen; 2007]. Devido à sua estrutura proteica e ao facto de desempenharem funções essenciais no desenvolvimento e controlo da divisão celular, são consideradas boas candidatas para o papel de demetilases de H3K4 no processo de XCI. Contrariamente a H3K4me2/3, H3K27me3 é uma modificação pós-transcripcional repressiva da cauda amino-terminal da histone H3. H3K27me3 é depositada na histona H3 pelo complexo PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) e reconhecida pelo complexo PRC1, que promove a ubiquitinação de H2AK119 e consequente condensação da cromatina [Kingston; 2010]. Ambos os complexos repressivos PRC1/2 estão presentes no cromossoma Xi. No entanto, o mecanismo pelo qual são recrutados está ainda por esclarecer (Silva et al., 2003). Recentemente, 5 estudos independentes identificaram a proteina JARID2 - da família Jumonji/ARID1 - como parte do complexo PRC2 [Shen; 2009] [Peng; 2009] [Pasini; 2010] [Li; 2010] [Landeira; 2010]. No entanto, estudos funcionais geraram resultados bastante conflituosos relativamente ao papel do JARID2 na actividade de metiltransferase de PRC2 e na regulação dos níveis de H3K27me3 nos genes alvo. Devido à sua associação com PRC2, e possível interação com PRC1 [Eberl, resultados não publicados], JARID2 potencialmente poderá ter um papel chave no recrutamento destes complexos para o cromossoma X durante XCI." Para explorar o papel destas proteinas, da família Jumonji/ARID1, durante a diferenciação e no contexto da XCI, transfectámos ESC femininas com BACs contendo um dos quatro genes com GFP fundido na extremidade carboxil (JARID1A/B/C e JARID2). Foram obtidas ESC transgénicas para todos eles excepto JARID1A, devido a um erro na inserção da GFP motivado pela incorrecta anotação do gene. Este poderoso sistema, juntamente com técnicas avançadas de microscopia, permitiu-nos localizar proteinas em ESC e descrever a sua cinética durante a diferenciação e XCI. Explorar o papel das demetilases de H3K4 na biologia das ESC e na XCI A análise dos padrões de expressão de JARID1B e JARID1C em ESC (não diferenciadas) condosiu-nos a um resultado bastante interessante. Em ESC, JARID1B-GFP (e JARID1B endógeno) e JARID1C-GFP apresentam uma expressão heterogénia. Curiosamente, a expressão de JARID1B, mas não a de JARID1C, está correlacionada negativamente com os níveis de H3K4me2/3 na célula. Células que expressam muito JARID1B apresentam baixos níveis de H3K4me2/3 e vice-versa. Estes dados sugerem que os níveis de expressão de JARID1B determinam os níveis globais de H3K4me2/3 em ESC. Estudos funcionais, tais como knock down (KD) ou knock out (KO) (trabalho em colaboração) e sobre-expressão de JARID1B (através dos clones JARID1BGFP) podem ser realizados para tentar explorar o impacto de JARID1 e dos níveis de metilação de H3K4 em ESC. Na tentativa de perceber a razão para este mosaicismo, testamos a hipótese da expressão de JARID1B estar correlacionada com o ciclo celular ou ser dependente de factores de pluripotência, como NANOG e OCT4. Os resultados preliminares obtidos (live cell imaging e imunoflorescência) não suportam nenhuma destas hipóteses. A possibilidade da variação na expressão de JARID1B ser estocástica numa população de ESC é, para nós, a mais aceite [Roesch; 2010]. De seguida fomos investigar se JARID1B-GFP e JARID1C-GFP são recrutados para o cromossoma X, durante XCI. Os nossos resultados mostraram que estas proteinas não são recrutadas para o Xi e são perdidas com uma dinâmica semelhante à perda de H3K4me2 , quando analisado por técnicas de IF/RNA FISH. No entanto, o seu papel na demetilação de H3K4 durante a XCI não pode ser para já excluido, pois a sua associação com a cromatina pode ser apenas transiente ou decorrer noutra altura do processo de inactivação. Técnicas como ChIP e ChIP-seq nos clones GFP-tagged permitir-nos-ão verificar com mais precisão se estas proteinas interactuam com alguma região do cromossoma X. Explorar o papel de JARID2 na metilação de H3K27 durante a XCI Neste trabalho, observamos pela primeira vez JARID2 ser recrutado para o Xi, durante o processo de XCI. O recrutamento tem início no 1º dia de diferenciação, é máximo no 2º dia e diminui ao 4º e 6º dias. Para perceber se JARID2 está envolvido nas funções dos complexos repressivos PRC1 e PRC2 durante a XCI, foi feita uma análise comparativa das suas cinéticas de recrutamento para o Xi. A nossa análise mostrou que JARID2 e EED (membro do PRC2) estão presentes aproximadamente no mesmo número de domínios, enquanto que RING1B (membro do PRC1) é observado apenas numa pequena fracção dos domínios. No entanto, uma análise mais detalhada em que observamos JARID2 e EED simultaneamente, mostra que a cinética de recrutamento destas duas proteinas é diferente. JARID2 atinge o seu nível máximo no 2º dia de diferenciação e decresce ao 4º dia, enquanto que EED não atinge um nível tão elevado ao 2º dia e permanece inalterado ao 4º dia. Outro resultado bastante interessante é o facto dos níveis de H3K27me3 aumentarem quando JARID2 diminui e PRC2 se mantem no Xi. Estes resultados apoiam em parte um modelo proposto no artigo [Peng; 2009]: JARID2 após ser recrutado para o Xi, possivelmente por ligação ao Xist RNA, iria promover a ligação de PRC2. Este, em complexo com JARID2, teria a sua actividade enzimática inibida e só se tornaria totalmente funcional (na trimetilação de H3K27) quando JARID2 é perdido do Xi. Estudos funcionais, com o objectivo de explorar a possível interdependência entre JARID2 e PRC2 no processo, já começaram a ser desenvolvidos com a criação de ESC KD para Jarid2 e ESC KD para Suz12 (membro do PRC2). Neste trabalho os BACs alterados com a inserção de GFP foram utilizados em experiências de localização de proteinas em celulas fixas e vivas. Além disto, as linhas celulares com BACGFP podem ser utilizadas para estudos de espectometria de massa para identificar complexos proteicos em que estão envolvidos e também para ChIP ou ChIP-seq para identificar os genes alvo destas proteinas [Poser; 2008]. Isto permitirá comprender melhor as funções destas proteinas em ESC e também na XCI se tiverem uma função nesse processo.