Publicação

Retinoic acid: a key regulator of vertebrate embryonic development

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O ácido retinóico é uma molécula sinalizadora, sintetizada a partir da vitamina A, necessária para o correto desenvolvimento embrionário dos vertebrados, uma vez que regula a transcrição de genes essenciais durante vários processos da embriogénese. A relação entre a sua produção e degradação, respetivamente através das enzimas Raldh2 e Cyp26a1, leva a que a sua atividade sinalizadora ocorra de uma forma bastante específica quer em termos de dose, localização da sua atuação (tecido) ou quer em termos temporais. De facto, a alteração dos níveis de ácido retinóico durante o desenvolvimento embrionário pode ser letal ou dar origem a doenças congénitas (como por exemplo, spina bífida). Uma das etapas mais importantes na embriogénese dos vertebrados é a gastrulação. Durante esta, para que a formação dos três folhetos germinativos (que mais tarde irão dar origem a todos os tecidos e órgãos do organismo) possa ocorrer devidamente, é necessário um correto controlo da atividade sinalizadora mediada pelo ácido retinóico, que nesta fase do desenvolvimento é fundamentalmente fornecido por via materna (caso dos ratinhos), dado que alterações na sua degradação enzimática pelas Cyp26 podem resultar na morte do embrião. Tal ocorre uma vez que o ácido retinóico controla a expressão de Nodal (excesso de ácido retinóico provoca a indução ectópica de Nodal), proteína indispensável para que se dê o início da gastrulação através da formação da linha primitiva, decorrente da migração das células do epiblasto para a parte mais posterior do embrião7. Aparentemente a introdução de um transgene (T-streakCreERT) juntamente com o alelo repórter ROSA26R-β-gal em ratinhos mutantes para o gene Gdf11, produziu letalidade embrionária durante a gastrulação8. Após verificarmos que o efeito não era devido ao transgene por si próprio, mas sim possivelmente ao local onde este foi inserido no genoma de uma linha particular (#47), procurámos caracterizar molecularmente os embriões Gdf11-/-::T-streak-CreERT#47+/0 de forma a tentar encontrar a causa desta aparente letalidade. A alteração dos níveis de ácido retinóico observada nos embriões Gdf11-/- durante a transição entre a formação de tecidos do tronco e da cauda, fez-nos considerar a possibilidade de durante a gastrulação ocorrer uma alteração semelhante desses níveis, que combinada com possíveis efeitos do transgene pudesse resultar na morte dos referidos embriões. No entanto, as experiências realizadas não só não permitiram a identificação de qualquer problema durante a gastrulação, decorrente da mutação no gene Gdf11 e/ou do transgene T-streak-CreERT#47+/0, como demonstraram a correta formação da linha primitiva nos embriões Gdf11-/-::T-streak-CreERT#47+/0. Estudos adicionais mostraram ainda viabilidade dos embriões Gdf11-/-::T-streak-CreERT#47+/0 a E10.5. Uma possível explicação para este facto prende-se com a estratégia utilizada na genotipagem do alelo mutante de Gdf11, pois usava iniciadores desenhados para amplificar parte da cassete de neomicina (introduzida para criar a mutação nesse gene9) que também está presente no alelo repórter ROSA26-β-gal, que formava parte das experiências originais que levaram à nossa hipótese inicial. Assim sendo, é bastante provável que os erros cometidos na determinação do genótipo dos progenitores dos embriões Gdf11::ROSA26R-β-gal+/0::T-streakCreERT#47+/0, tenham levado a utilizar ratinhos Gdf11+/+ e não Gdf11+/- nos cruzamentos, criando a ilusão de uma ausência de embriões Gdf11-/- nestas ninhadas. De qualquer forma, relativamente à hipótese da alteração dos níveis de ácido retinóico nos mutantes Gdf11, foi possível concluir que aparentemente essa alteração não se verifica durante a gastrulação, uma vez que a expressão tanto de Cyp26a1, como de Nodal permaneceram sem alterações. Após a gastrulação, nos vertebrados, dá-se primeiro a formação da cabeça (na parte mais anterior do embrião) e depois por um processo de extensão axial, no sentido anterior para posterior, é formado o pescoço, a seguir o tronco e por último a cauda. Apesar do desenvolvimento destas estruturas ser progressivo e de depender dos progenitores axiais, parece que a forma como estas diferentes partes do corpo são criadas é diferente. Mutações nos genes T, Cdx e Wnt3a suportam esta teoria, segundo a qual a posição dos membros superiores e inferiores delimita os referidos blocos estruturais do embrião (cabeça/pescoço, tronco e cauda). Como referido anteriormente, o mecanismo segundo o qual ocorre a transição tronco-cauda já foi demonstrado pelo nosso laboratório, mas a transição entre a formação da cabeça e do tronco ainda permanece por esclarecer. Curiosamente a mutação da enzima Raldh2, que leva à inexistência de ácido retinóico nos tecidos neurais e na mesoderme, leva à morte do embrião após o desenvolvimento ser interrompido ao nível dos membros anteriores. Mas, se for administrado ácido retinóico até essa altura do desenvolvimento (~E8.25) o embrião é capaz de ultrapassar esse bloqueio e formar as seguintes estruturas (tronco e cauda). Esse facto fez-nos considerar a hipótese de que o ácido retinóico pode estar a controlar o mecanismo de transição entre a formação da cabeça e do tronco. Para identificar essa necessária mudança nos progenitores axiais, dependente do ácido retinóico, efetuámos uma análise transcriptómica comparativa a partir de ARN isolado das caudas de embriões “tipo selvagem” a E8.75/E9.0 (ou seja, onde a transição já foi efetuada e estão a ser criados os tecidos do tronco) e de embriões Raldh2-/- da mesma idade (nos quais esta transição encontra-se bloqueada). Após análise dos resultados presentes na RNA-seq, foi selecionado um grupo de genes candidatos com base na grandeza da expressão diferencial observada entre embriões tipo selvagem e Raldh2-/-, e tendo em conta a sua significância e função biológica. Vários genes desse grupo (exemplo: Wnt3a, Dkk1 e Cav1) estão associados à sinalização Wnt, cuja atividade canónica (via -catenina) parece estar diminuída na cauda dos embriões mutantes. Esta observação é bastante interessante, tendo em conta a comparação dos fenótipos dos embriões mutantes para Wnt3 (que apresentam ausência total de mesoderme), com o fenótipo dos embriões Wnt3a-/- (em que o desenvolvimento apenas ocorre de forma normal até ao nível do membro anterior), sugerindo que a atividade do ácido retinóico possa ser responsável por esta mudança na sinalização Wnt (de depender de Wnt3 e passar a depender de Wnt3a). Sendo que esta hipótese contrasta com a observação de que a expressão de Wnt3a parece estar aumentada na cauda dos mutantes, é possível que a existência de regulação diferencial dos vários componentes da sinalização Wnt nos embriões Raldh2-/- possa resultar na incapacidade dos progenitores de responder apropriadamente a Wnt3a, ocorrendo dessa forma a inibição da sinalização canónica de Wnt. Por esse motivo, através de hibridação in situ procurámos observar a expressão de alguns desses genes envolvidos na sinalização Wnt e complementámos esses estudos com uma abordagem de sobre-expressão através da utilização de transgénicos (onde o gene avaliado foi associado ao promotor de Cdx2 que expressa nos progenitores do eixo). Estudos similares foram também feitos com outros genes não associados à sinalização Wnt (Mesp1 e Fgf4). No entanto as nossas experiências não permitiram determinar o mecanismo inerente à mudança nos progenitores, necessária para que o embrião termine de criar tecidos da cabeça e inicie a produção de tecidos do tronco. Ainda sobre a forma como a atividade do ácido retinóico influência os progenitores axiais, através de hibridação in situ, confirmámos que na mesoderme pré-somítica, a área onde tanto T como Sox2 são expressos é menor nos embriões Raldh2-/-. Em experiências preliminares foi possível observar, através de imunofluorescência, a existência de células que expressam T e Sox2 (apesar de não ter sido possível contabilizá-las), indicando dessa forma a presença dos progenitores axiais nos embriões Raldh2-/-. Por último, surpreendentemente ao que está publicado, verificámos que em alguns embriões Raldh2-/- é possível observar umas pequenas protuberâncias onde Tbx5 (marcador da indução dos membros anteriores) encontra-se expresso mais tarde no desenvolvimento (do que aquilo que seria suposto) e em menor quantidade. Por isso, considerando o fenótipo decorrente da mutação de Cyp26a1 (onde ocorre uma transformação homeótica da vertebra cervical C5 para C6 e da C7 para uma vertebra torácica), é possível que o ácido retinóico seja crucial durante este período do desenvolvimento, definindo o tempo em que ocorre a transição entre a formação da cabeça (pescoço) e do tronco no embrião. Apesar desta hipótese necessitar de uma validação experimental, conectando a transição cabeça-tronco e a indução dos membros anteriores, todas as evidências apontam no sentido de que a atividade do ácido retinóico nos progenitores axiais é apenas necessária durante a transição cabeça-tronco (e não durante todo o processo de extensão axial) sendo depois restringida, pela Cyp26a1, a zonas mais anteriores do embrião.
Autores principais:	Dias, André Miguel Gomes Duarte de Sousa
Assunto:	Ácido retinóico Raldh2 Transição cabeça tronco Progenitores axiais e Gdf11 Teses de mestrado - 2015
Ano:	2015
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O ácido retinóico é uma molécula sinalizadora, sintetizada a partir da vitamina A, necessária para o correto desenvolvimento embrionário dos vertebrados, uma vez que regula a transcrição de genes essenciais durante vários processos da embriogénese. A relação entre a sua produção e degradação, respetivamente através das enzimas Raldh2 e Cyp26a1, leva a que a sua atividade sinalizadora ocorra de uma forma bastante específica quer em termos de dose, localização da sua atuação (tecido) ou quer em termos temporais. De facto, a alteração dos níveis de ácido retinóico durante o desenvolvimento embrionário pode ser letal ou dar origem a doenças congénitas (como por exemplo, spina bífida). Uma das etapas mais importantes na embriogénese dos vertebrados é a gastrulação. Durante esta, para que a formação dos três folhetos germinativos (que mais tarde irão dar origem a todos os tecidos e órgãos do organismo) possa ocorrer devidamente, é necessário um correto controlo da atividade sinalizadora mediada pelo ácido retinóico, que nesta fase do desenvolvimento é fundamentalmente fornecido por via materna (caso dos ratinhos), dado que alterações na sua degradação enzimática pelas Cyp26 podem resultar na morte do embrião. Tal ocorre uma vez que o ácido retinóico controla a expressão de Nodal (excesso de ácido retinóico provoca a indução ectópica de Nodal), proteína indispensável para que se dê o início da gastrulação através da formação da linha primitiva, decorrente da migração das células do epiblasto para a parte mais posterior do embrião7. Aparentemente a introdução de um transgene (T-streakCreERT) juntamente com o alelo repórter ROSA26R-β-gal em ratinhos mutantes para o gene Gdf11, produziu letalidade embrionária durante a gastrulação8. Após verificarmos que o efeito não era devido ao transgene por si próprio, mas sim possivelmente ao local onde este foi inserido no genoma de uma linha particular (#47), procurámos caracterizar molecularmente os embriões Gdf11-/-::T-streak-CreERT#47+/0 de forma a tentar encontrar a causa desta aparente letalidade. A alteração dos níveis de ácido retinóico observada nos embriões Gdf11-/- durante a transição entre a formação de tecidos do tronco e da cauda, fez-nos considerar a possibilidade de durante a gastrulação ocorrer uma alteração semelhante desses níveis, que combinada com possíveis efeitos do transgene pudesse resultar na morte dos referidos embriões. No entanto, as experiências realizadas não só não permitiram a identificação de qualquer problema durante a gastrulação, decorrente da mutação no gene Gdf11 e/ou do transgene T-streak-CreERT#47+/0, como demonstraram a correta formação da linha primitiva nos embriões Gdf11-/-::T-streak-CreERT#47+/0. Estudos adicionais mostraram ainda viabilidade dos embriões Gdf11-/-::T-streak-CreERT#47+/0 a E10.5. Uma possível explicação para este facto prende-se com a estratégia utilizada na genotipagem do alelo mutante de Gdf11, pois usava iniciadores desenhados para amplificar parte da cassete de neomicina (introduzida para criar a mutação nesse gene9) que também está presente no alelo repórter ROSA26-β-gal, que formava parte das experiências originais que levaram à nossa hipótese inicial. Assim sendo, é bastante provável que os erros cometidos na determinação do genótipo dos progenitores dos embriões Gdf11::ROSA26R-β-gal+/0::T-streakCreERT#47+/0, tenham levado a utilizar ratinhos Gdf11+/+ e não Gdf11+/- nos cruzamentos, criando a ilusão de uma ausência de embriões Gdf11-/- nestas ninhadas. De qualquer forma, relativamente à hipótese da alteração dos níveis de ácido retinóico nos mutantes Gdf11, foi possível concluir que aparentemente essa alteração não se verifica durante a gastrulação, uma vez que a expressão tanto de Cyp26a1, como de Nodal permaneceram sem alterações. Após a gastrulação, nos vertebrados, dá-se primeiro a formação da cabeça (na parte mais anterior do embrião) e depois por um processo de extensão axial, no sentido anterior para posterior, é formado o pescoço, a seguir o tronco e por último a cauda. Apesar do desenvolvimento destas estruturas ser progressivo e de depender dos progenitores axiais, parece que a forma como estas diferentes partes do corpo são criadas é diferente. Mutações nos genes T, Cdx e Wnt3a suportam esta teoria, segundo a qual a posição dos membros superiores e inferiores delimita os referidos blocos estruturais do embrião (cabeça/pescoço, tronco e cauda). Como referido anteriormente, o mecanismo segundo o qual ocorre a transição tronco-cauda já foi demonstrado pelo nosso laboratório, mas a transição entre a formação da cabeça e do tronco ainda permanece por esclarecer. Curiosamente a mutação da enzima Raldh2, que leva à inexistência de ácido retinóico nos tecidos neurais e na mesoderme, leva à morte do embrião após o desenvolvimento ser interrompido ao nível dos membros anteriores. Mas, se for administrado ácido retinóico até essa altura do desenvolvimento (~E8.25) o embrião é capaz de ultrapassar esse bloqueio e formar as seguintes estruturas (tronco e cauda). Esse facto fez-nos considerar a hipótese de que o ácido retinóico pode estar a controlar o mecanismo de transição entre a formação da cabeça e do tronco. Para identificar essa necessária mudança nos progenitores axiais, dependente do ácido retinóico, efetuámos uma análise transcriptómica comparativa a partir de ARN isolado das caudas de embriões “tipo selvagem” a E8.75/E9.0 (ou seja, onde a transição já foi efetuada e estão a ser criados os tecidos do tronco) e de embriões Raldh2-/- da mesma idade (nos quais esta transição encontra-se bloqueada). Após análise dos resultados presentes na RNA-seq, foi selecionado um grupo de genes candidatos com base na grandeza da expressão diferencial observada entre embriões tipo selvagem e Raldh2-/-, e tendo em conta a sua significância e função biológica. Vários genes desse grupo (exemplo: Wnt3a, Dkk1 e Cav1) estão associados à sinalização Wnt, cuja atividade canónica (via -catenina) parece estar diminuída na cauda dos embriões mutantes. Esta observação é bastante interessante, tendo em conta a comparação dos fenótipos dos embriões mutantes para Wnt3 (que apresentam ausência total de mesoderme), com o fenótipo dos embriões Wnt3a-/- (em que o desenvolvimento apenas ocorre de forma normal até ao nível do membro anterior), sugerindo que a atividade do ácido retinóico possa ser responsável por esta mudança na sinalização Wnt (de depender de Wnt3 e passar a depender de Wnt3a). Sendo que esta hipótese contrasta com a observação de que a expressão de Wnt3a parece estar aumentada na cauda dos mutantes, é possível que a existência de regulação diferencial dos vários componentes da sinalização Wnt nos embriões Raldh2-/- possa resultar na incapacidade dos progenitores de responder apropriadamente a Wnt3a, ocorrendo dessa forma a inibição da sinalização canónica de Wnt. Por esse motivo, através de hibridação in situ procurámos observar a expressão de alguns desses genes envolvidos na sinalização Wnt e complementámos esses estudos com uma abordagem de sobre-expressão através da utilização de transgénicos (onde o gene avaliado foi associado ao promotor de Cdx2 que expressa nos progenitores do eixo). Estudos similares foram também feitos com outros genes não associados à sinalização Wnt (Mesp1 e Fgf4). No entanto as nossas experiências não permitiram determinar o mecanismo inerente à mudança nos progenitores, necessária para que o embrião termine de criar tecidos da cabeça e inicie a produção de tecidos do tronco. Ainda sobre a forma como a atividade do ácido retinóico influência os progenitores axiais, através de hibridação in situ, confirmámos que na mesoderme pré-somítica, a área onde tanto T como Sox2 são expressos é menor nos embriões Raldh2-/-. Em experiências preliminares foi possível observar, através de imunofluorescência, a existência de células que expressam T e Sox2 (apesar de não ter sido possível contabilizá-las), indicando dessa forma a presença dos progenitores axiais nos embriões Raldh2-/-. Por último, surpreendentemente ao que está publicado, verificámos que em alguns embriões Raldh2-/- é possível observar umas pequenas protuberâncias onde Tbx5 (marcador da indução dos membros anteriores) encontra-se expresso mais tarde no desenvolvimento (do que aquilo que seria suposto) e em menor quantidade. Por isso, considerando o fenótipo decorrente da mutação de Cyp26a1 (onde ocorre uma transformação homeótica da vertebra cervical C5 para C6 e da C7 para uma vertebra torácica), é possível que o ácido retinóico seja crucial durante este período do desenvolvimento, definindo o tempo em que ocorre a transição entre a formação da cabeça (pescoço) e do tronco no embrião. Apesar desta hipótese necessitar de uma validação experimental, conectando a transição cabeça-tronco e a indução dos membros anteriores, todas as evidências apontam no sentido de que a atividade do ácido retinóico nos progenitores axiais é apenas necessária durante a transição cabeça-tronco (e não durante todo o processo de extensão axial) sendo depois restringida, pela Cyp26a1, a zonas mais anteriores do embrião.