Publicação

Assessment of hiPSC derived cardiomyocytes maturation in extended culture by analysis of alternative splicing expression patterns

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A patologia cardiovascular é um dos maiores problemas de saúde pública e uma das principais causas de morte a nível mundial. Apesar de o impacto socioeconómico destas patologias ser tão demarcado, e ser previsto que a incidência das mesmas venha a aumentar drasticamente nos próximos anos, os mecanismos celulares e moleculares que desencadeiam as doenças cardiovasculares são amplamente desconhecidos. Uma forma de melhor compreender estas doenças é o uso de modelos de doença. Contudo, até à data, a investigação na área foi dificultada pela falta de modelos adequados. As células pluripotentes induzidas são células com alta capacidade de proliferação e que podem ser diferenciadas em qualquer tipo celular de um organismo adulto. Estas células trazem enormes vantagens e carregam menos implicações éticas que alternativas derivadas de embriões. O recente desenvolvimento de protocolos que permitem de forma eficiente diferenciar estas células em cardiomiócitos funcionais é uma nova e promissora forma de obter grandes quantidades de células cardíacas, que proporciona grandes vantagens na modelagem da doença cardíaca. No entanto, a necessidade de determinar se cardiomiócitos diferenciados in vitro de células pluripotentes induzidas recapitulam características cardíacas específicas, criou recentemente uma área de pesquisa intensa e os cardiomiócitos derivados de células pluripotentes têm sido caracterizados na literatura como sendo imaturos, tanto a níveis morfológicos como fisiológicos. O “splicing” é um fenómeno que afeta a maioria dos genes humanos e permite a produção de proteínas diferentes a partir do mesmo gene. Estas diferentes isoformas proteicas permitem às células adaptarem-se as constantes alterações fisiológicas que enfrentam. Entender como o “splicing” alternativo contribui para a regulação da expressão dos genes cardíacos pode ajudar a elucidar os mecanismos subjacentes a inúmeras patologias cardíacas. Trabalhos recentes revelam o papel crucial do “splicing” alternativo no desenvolvimento cardíaco e também doença cardíaca. Outras publicações mostram que o “splicing” em cardiomiócitos derivados de células pluripotentes induzidas é idêntico ao de cardiomiócitos fetais, mas que este “splicing” pode sofrer alterações e assemelhar-se mais ao “splicing” no coração adulto aumentando o tempo de cultura das células. Aqui, foi investigado o “splicing” alternativo de genes sarcoméricos ao longo da diferenciação de cardiomiócitos derivados de células pluripotentes induzidas e foi avaliada a sua progressão ao longo de 60 dias em cultura. Foram também realizadas análises de imunofluorescência, para permitir aferir o grau de diferenciação dos cardiomiócitos obtidos por outros parâmetros. Foi analisada a troponina cardíaca 2 (TNNT2), a miomesina 1 (MYOM1) e a titina (TTN). Observamos que esses genes começam a ser expressos no dia 8 da diferenciação, com isoformas características de baixa maturação a representar a maioria dos transcritos. No dia 30, foi detetada uma mudança nas isoformas de TNNT2 e TTN, com expressão aumentada de isoformas adultas. Observou-se um aumento adicional no dia 60 para o gene da TNNT2, mas não para o gene da titina o que pode implicar que culturas superiores a um mês não são vantajosas para a alteração de “splicing” deste gene. No caso do gene da miomesina o rácio de isoforma precoce permanece inalterado desde o dia 13 até ao dia 60. Isto pode significar que este gene não é adequado para a quantificação da maturação ou que períodos de cultura mais duradouros não são suficientes para induzir maturação ao nível deste gene. Os resultados expressão génica que mostram maturação foram corroborados por análises de imunofluorescência realizadas. Estes mostram um aumento da dimensão dos cardiomiócitos e da organização das fibras do sarcómero quando comparando imagens de células no dia 13 de diferenciação e células no dia 30. Em conclusão, os resultados indicam que um período prolongado até 30 dias de cultura de células é suficiente para induzir mudanças no “splicing” de TNNT2 e TTN, sendo que no caso do TNNT2 culturas mais prolongadas podem ser vantajosas, o que não parece ser verdade no caso da TTN. Embora os cardimiócitos obtidos após longos períodos de cultura sejam mais semelhantes aos do coração humano adulto, estes não recapitulam completamente os seus padrões de “splicing”. Apesar disto, este estudo realça a relevância das culturas de longo prazo na investigação cardiovascular e no desenvolvimento de modelos de doença fidedignos. No futuro seria interessante estudar o efeito de outros estímulos nos padrões de “splicing” destas células, como fatores químicos, estimulação elétrica, cultura em substratos mais rígidos e modelos em 3 dimensões, que têm sido mostrados como promotores de maturação, para características como a morfologia e a força contrátil.
Autores principais:	Gonçalves, Rodrigo Paiva
Assunto:	Patologia cardíaca Cardiomiócitos Desenvolvimento Diferenciação cardíaca "Splicing" alternativo Teses de mestrado - 2017
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A patologia cardiovascular é um dos maiores problemas de saúde pública e uma das principais causas de morte a nível mundial. Apesar de o impacto socioeconómico destas patologias ser tão demarcado, e ser previsto que a incidência das mesmas venha a aumentar drasticamente nos próximos anos, os mecanismos celulares e moleculares que desencadeiam as doenças cardiovasculares são amplamente desconhecidos. Uma forma de melhor compreender estas doenças é o uso de modelos de doença. Contudo, até à data, a investigação na área foi dificultada pela falta de modelos adequados. As células pluripotentes induzidas são células com alta capacidade de proliferação e que podem ser diferenciadas em qualquer tipo celular de um organismo adulto. Estas células trazem enormes vantagens e carregam menos implicações éticas que alternativas derivadas de embriões. O recente desenvolvimento de protocolos que permitem de forma eficiente diferenciar estas células em cardiomiócitos funcionais é uma nova e promissora forma de obter grandes quantidades de células cardíacas, que proporciona grandes vantagens na modelagem da doença cardíaca. No entanto, a necessidade de determinar se cardiomiócitos diferenciados in vitro de células pluripotentes induzidas recapitulam características cardíacas específicas, criou recentemente uma área de pesquisa intensa e os cardiomiócitos derivados de células pluripotentes têm sido caracterizados na literatura como sendo imaturos, tanto a níveis morfológicos como fisiológicos. O “splicing” é um fenómeno que afeta a maioria dos genes humanos e permite a produção de proteínas diferentes a partir do mesmo gene. Estas diferentes isoformas proteicas permitem às células adaptarem-se as constantes alterações fisiológicas que enfrentam. Entender como o “splicing” alternativo contribui para a regulação da expressão dos genes cardíacos pode ajudar a elucidar os mecanismos subjacentes a inúmeras patologias cardíacas. Trabalhos recentes revelam o papel crucial do “splicing” alternativo no desenvolvimento cardíaco e também doença cardíaca. Outras publicações mostram que o “splicing” em cardiomiócitos derivados de células pluripotentes induzidas é idêntico ao de cardiomiócitos fetais, mas que este “splicing” pode sofrer alterações e assemelhar-se mais ao “splicing” no coração adulto aumentando o tempo de cultura das células. Aqui, foi investigado o “splicing” alternativo de genes sarcoméricos ao longo da diferenciação de cardiomiócitos derivados de células pluripotentes induzidas e foi avaliada a sua progressão ao longo de 60 dias em cultura. Foram também realizadas análises de imunofluorescência, para permitir aferir o grau de diferenciação dos cardiomiócitos obtidos por outros parâmetros. Foi analisada a troponina cardíaca 2 (TNNT2), a miomesina 1 (MYOM1) e a titina (TTN). Observamos que esses genes começam a ser expressos no dia 8 da diferenciação, com isoformas características de baixa maturação a representar a maioria dos transcritos. No dia 30, foi detetada uma mudança nas isoformas de TNNT2 e TTN, com expressão aumentada de isoformas adultas. Observou-se um aumento adicional no dia 60 para o gene da TNNT2, mas não para o gene da titina o que pode implicar que culturas superiores a um mês não são vantajosas para a alteração de “splicing” deste gene. No caso do gene da miomesina o rácio de isoforma precoce permanece inalterado desde o dia 13 até ao dia 60. Isto pode significar que este gene não é adequado para a quantificação da maturação ou que períodos de cultura mais duradouros não são suficientes para induzir maturação ao nível deste gene. Os resultados expressão génica que mostram maturação foram corroborados por análises de imunofluorescência realizadas. Estes mostram um aumento da dimensão dos cardiomiócitos e da organização das fibras do sarcómero quando comparando imagens de células no dia 13 de diferenciação e células no dia 30. Em conclusão, os resultados indicam que um período prolongado até 30 dias de cultura de células é suficiente para induzir mudanças no “splicing” de TNNT2 e TTN, sendo que no caso do TNNT2 culturas mais prolongadas podem ser vantajosas, o que não parece ser verdade no caso da TTN. Embora os cardimiócitos obtidos após longos períodos de cultura sejam mais semelhantes aos do coração humano adulto, estes não recapitulam completamente os seus padrões de “splicing”. Apesar disto, este estudo realça a relevância das culturas de longo prazo na investigação cardiovascular e no desenvolvimento de modelos de doença fidedignos. No futuro seria interessante estudar o efeito de outros estímulos nos padrões de “splicing” destas células, como fatores químicos, estimulação elétrica, cultura em substratos mais rígidos e modelos em 3 dimensões, que têm sido mostrados como promotores de maturação, para características como a morfologia e a força contrátil.