Publicação
Identification of NF-kB and MYC binding motifs in Herpesvirus ORF73
| Resumo: | O herpesvírus murídeo tipo 4, MuHV-4, é um gama-herpesvírus e, enquanto tal, estabelece infecções latentes em tecidos linfóides. Durante a infecção latente, o genoma de MuHV-4 persiste sob a forma de um epissoma no núcleo das células latentemente infectadas, e várias proteínas são expressas, entre as quais a proteína ORF73. Além do seu papel putativo na manutenção do epissoma viral, ORF73 modula os factores de transcrição celulares NF-kB e MYC, através do recrutamento das proteínas celulares Elonguina C e Culina 5, o que leva à formação do complexo de ligase de ubiquitina EC5SORF73 (ElonguinaC–Culina5–SOCS). O complexo EC5SORF73 interage com p65/RelA, um dos membros da família NF-kB, promovendo a sua poli-ubiquitinação e, consequentemente, a sua degradação pelo proteossoma. O complexo EC5SORF73 promove ainda a poli-ubiquitinação de MYC, o que resulta na estabilização desta proteína em vez da sua degradação, como se verifica para p65/RelA. Deste modo, ORF73 tem efeitos contrários sobre NF-kB e MYC, inibindo a actividade transcricional de NF-kB, mas activando a actividade transcricional de MYC. Recentemente, foi identificado um motivo na proteína ORF73, o motivo SOCS-box (resíduos 199–215), que é responsável pelo recrutamento das proteínas Elonguina C e Culina 5 e, consequentemente, pela formação do complexo EC5SORF73. A delecção funcional do motivo SOCS-box de ORF73, originando a proteína mutante ORF73–SOCS, impede a proteína viral de mediar tanto a poli-ubiquitinação de p65/RelA como a poli-ubiquitinação de MYC, comprometendo simultaneamente a sua capacidade de inibir a actividade transcricional de NF-kB e de activar a actividade transcricional de MYC, embora o mutante ORF73–SOCS mantenha intacta a capacidade de se ligar a ambos os factores celulares. Esta mutação suprime ainda a expansão do vírus MuHV-4 em células B e impede a infecção persistente in vivo. No entanto, como a mutação do motivo SOCS-box impede ORF73 de inibir NF-kB e de activar MYC em simultâneo, não é possível distinguir, em termos de fenótipo de infecção latente, o fenótipo que é devido à inibição de NF-kB e o fenótipo que resulta da activação de MYC. Além disso, a possibilidade de ORF73 mediar a poli-ubiquitinação de outros alvos celulares, ainda não identificados, não deve ser excluída. Portanto, é importante identificar regiões da proteína ORF73 cuja mutação permita segregar as suas funções modulatórias sobre os substratos celulares. A mutação dos motivos de ORF73 envolvidos na ligação a p65/RelA e a MYC constitui uma boa alternativa à mutação do motivo SOCS-box. Contudo, estes motivos de ligação ao substrato ainda não foram identificados, tendo sido apenas demonstrado que a região N-terminal de ORF73 (resíduos 1–140) é indispensável para a interacção de ORF73 com p65/RelA e MYC. A identificação dos motivos de ligação ao substrato na proteína ORF73 será importante para, em futuras experiências, construir vírus recombinantes que sejam incapazes de interagir e, consequentemente, de modular a actividade transcricional de NF-kB e de MYC, em separado. Deste modo, será possível distinguir os efeitos da inibição de NF-kB dos efeitos da activação de MYC sobre o fenótipo de MuHV-4, durante a infecção latente. O principal objectivo deste projecto foi a identificação de resíduos de aminoácidos específicos na proteína ORF73 necessários para a sua ligação a MYC ou a p65/RelA. Para tal, quinze proteínas ORF73 mutantes foram construídas, através de mutagénese por scanning de alanina na porção N-terminal de ORF73. Esta técnica consiste na substituição dos resíduos-alvo por resíduos de alanina, os quais permitem eliminar as cadeias laterais para além do carbono β, sem alterar a conformação da cadeia principal e sem impor efeitos electrostáticos extremos. A interacção dos mutantes de ORF73 com MYC e p65/RelA foi depois testada em experiências de co-imunoprecipitação. Os mutantes que interagiram fracamente com estas proteínas celulares foram sujeitos a ensaios funcionais, de modo a confirmar a diminuição da sua capacidade de modular MYC ou NF-kB. Deste modo, realizaram-se ensaios de gene repórter para testar se a perda de ligação de ORF73 a MYC ou a p65/RelA resultou na abolição da sua acção modulatória sobre a actividade transcricional destes factores celulares, e ainda ensaios de poli-ubiquitinação para investigar se essa perda de ligação se traduziu na perda da actividade de ligase de ubiquitina de ORF73. A capacidade destes mutantes para recrutarem os componentes do complexo EC5SORF73 também foi avaliada, através de experiências de co-imunoprecipitação com as proteínas Elonguina C e Culina 5. As experiências de co-imunoprecipitação com MYC ou p65/RelA e os mutantes de ORF73 que foram construídos permitiram identificar dois mutantes com uma capacidade comprometida para interagirem com estes factores celulares. O mutante ORF73141KKY143, com os resíduos 141KKY143 substituídos por alaninas, demonstrou uma severa diminuição na sua capacidade de interagir com MYC e p65/RelA, sugerindo que os resíduos 141KKY143 são importantes para a ligação de ORF73 a MYC e a p65/RelA. Por outro lado, o mutante ORF73138PLP140, com os resíduos 138PLP140 substituídos por alaninas, revelou uma diminuição parcial da sua capacidade de interagir com MYC, tendo permanecido intacta a sua capacidade de interagir com p65/RelA, o que indica que os resíduos 138PLP140 têm um papel na ligação de ORF73 a MYC, mas não na ligação a p65/RelA. Contudo, os mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 comportaram-se da mesma forma nos ensaios de gene repórter, sendo incapazes de activar a actividade transcricional de MYC e apresentando uma diminuição parcial do seu efeito inibitório sobre NF-kB, o que indica que tanto a mutação dos resíduos 141KKY143 como a mutação dos resíduos 138PLP140 afectam a acção modulatória de ORF73 sobre MYC e sobre NF-kB. Os resultados dos ensaios de poli-ubiquitinação mostraram estar de acordo com as observações dos ensaios de gene repórter, uma vez que ambos os mutantes foram incapazes de promover a poli-ubiquitinação de MYC e de p65/RelA, reforçando a ideia de que os resíduos 141KKY143 e 138PLP140 são importantes para a modulação de MYC e de NF-kB pela proteína ORF73. De seguida, a capacidade dos mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 para recrutarem a Elonguina C e a Culina 5, componentes do complexo EC5SORF73, foi avaliada através de experiências de co-imunoprecipitação. Ambos os mutantes recrutaram a Culina 5, mas foram incapazes de recrutar a Elonguina C, comprometendo assim a formação do complexo EC5SORF73 e, consequentemente, suprimindo a função de ligase de ubiquitina de ORF73. O facto de os mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 não conseguirem recrutar a Elonguina C, embora não tivessem mutações no motivo SOCS-box, sugere que as mutações introduzidas nos resíduos 141KKY143 e 138PLP140 tiveram um impacto severo na estrutura tridimensional de ORF73, possivelmente afectando outras funções da proteína viral, como o seu papel putativo na manutenção do epissoma. Este trabalho demonstrou ainda que a actividade de ligase de ubiquitina dos mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 estava comprometida, à semelhança do que se verificou com o mutante ORF73–SOCS, acima referido. Deste modo, não será possível clarificar, através da utilização destes mutantes em estudos in vivo, a contribuição independente da activação de MYC e da inibição de NF-kB pela proteína viral ORF73, durante a infecção latente de MuHV-4. Portanto, é necessário desenvolver outras estratégias para identificar os motivos de ligação de ORF73 a MYC e a p65/RelA, de modo a tornar possível a construção de mutantes de ORF73 que sejam incapazes de modular cada uma destas proteínas celulares separadamente. A resolução da estrutura tridimensional de ORF73, através de técnicas de cristalografia, pode dar um importante contributo para estes estudos. |
|---|---|
| Autores principais: | Cerqueira, Sofia Isabel Arriaga Mimoso, 1988- |
| Assunto: | Virologia Herpesvirus Proteínas Mutagénese Teses de mestrado - 2011 |
| Ano: | 2011 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | O herpesvírus murídeo tipo 4, MuHV-4, é um gama-herpesvírus e, enquanto tal, estabelece infecções latentes em tecidos linfóides. Durante a infecção latente, o genoma de MuHV-4 persiste sob a forma de um epissoma no núcleo das células latentemente infectadas, e várias proteínas são expressas, entre as quais a proteína ORF73. Além do seu papel putativo na manutenção do epissoma viral, ORF73 modula os factores de transcrição celulares NF-kB e MYC, através do recrutamento das proteínas celulares Elonguina C e Culina 5, o que leva à formação do complexo de ligase de ubiquitina EC5SORF73 (ElonguinaC–Culina5–SOCS). O complexo EC5SORF73 interage com p65/RelA, um dos membros da família NF-kB, promovendo a sua poli-ubiquitinação e, consequentemente, a sua degradação pelo proteossoma. O complexo EC5SORF73 promove ainda a poli-ubiquitinação de MYC, o que resulta na estabilização desta proteína em vez da sua degradação, como se verifica para p65/RelA. Deste modo, ORF73 tem efeitos contrários sobre NF-kB e MYC, inibindo a actividade transcricional de NF-kB, mas activando a actividade transcricional de MYC. Recentemente, foi identificado um motivo na proteína ORF73, o motivo SOCS-box (resíduos 199–215), que é responsável pelo recrutamento das proteínas Elonguina C e Culina 5 e, consequentemente, pela formação do complexo EC5SORF73. A delecção funcional do motivo SOCS-box de ORF73, originando a proteína mutante ORF73–SOCS, impede a proteína viral de mediar tanto a poli-ubiquitinação de p65/RelA como a poli-ubiquitinação de MYC, comprometendo simultaneamente a sua capacidade de inibir a actividade transcricional de NF-kB e de activar a actividade transcricional de MYC, embora o mutante ORF73–SOCS mantenha intacta a capacidade de se ligar a ambos os factores celulares. Esta mutação suprime ainda a expansão do vírus MuHV-4 em células B e impede a infecção persistente in vivo. No entanto, como a mutação do motivo SOCS-box impede ORF73 de inibir NF-kB e de activar MYC em simultâneo, não é possível distinguir, em termos de fenótipo de infecção latente, o fenótipo que é devido à inibição de NF-kB e o fenótipo que resulta da activação de MYC. Além disso, a possibilidade de ORF73 mediar a poli-ubiquitinação de outros alvos celulares, ainda não identificados, não deve ser excluída. Portanto, é importante identificar regiões da proteína ORF73 cuja mutação permita segregar as suas funções modulatórias sobre os substratos celulares. A mutação dos motivos de ORF73 envolvidos na ligação a p65/RelA e a MYC constitui uma boa alternativa à mutação do motivo SOCS-box. Contudo, estes motivos de ligação ao substrato ainda não foram identificados, tendo sido apenas demonstrado que a região N-terminal de ORF73 (resíduos 1–140) é indispensável para a interacção de ORF73 com p65/RelA e MYC. A identificação dos motivos de ligação ao substrato na proteína ORF73 será importante para, em futuras experiências, construir vírus recombinantes que sejam incapazes de interagir e, consequentemente, de modular a actividade transcricional de NF-kB e de MYC, em separado. Deste modo, será possível distinguir os efeitos da inibição de NF-kB dos efeitos da activação de MYC sobre o fenótipo de MuHV-4, durante a infecção latente. O principal objectivo deste projecto foi a identificação de resíduos de aminoácidos específicos na proteína ORF73 necessários para a sua ligação a MYC ou a p65/RelA. Para tal, quinze proteínas ORF73 mutantes foram construídas, através de mutagénese por scanning de alanina na porção N-terminal de ORF73. Esta técnica consiste na substituição dos resíduos-alvo por resíduos de alanina, os quais permitem eliminar as cadeias laterais para além do carbono β, sem alterar a conformação da cadeia principal e sem impor efeitos electrostáticos extremos. A interacção dos mutantes de ORF73 com MYC e p65/RelA foi depois testada em experiências de co-imunoprecipitação. Os mutantes que interagiram fracamente com estas proteínas celulares foram sujeitos a ensaios funcionais, de modo a confirmar a diminuição da sua capacidade de modular MYC ou NF-kB. Deste modo, realizaram-se ensaios de gene repórter para testar se a perda de ligação de ORF73 a MYC ou a p65/RelA resultou na abolição da sua acção modulatória sobre a actividade transcricional destes factores celulares, e ainda ensaios de poli-ubiquitinação para investigar se essa perda de ligação se traduziu na perda da actividade de ligase de ubiquitina de ORF73. A capacidade destes mutantes para recrutarem os componentes do complexo EC5SORF73 também foi avaliada, através de experiências de co-imunoprecipitação com as proteínas Elonguina C e Culina 5. As experiências de co-imunoprecipitação com MYC ou p65/RelA e os mutantes de ORF73 que foram construídos permitiram identificar dois mutantes com uma capacidade comprometida para interagirem com estes factores celulares. O mutante ORF73141KKY143, com os resíduos 141KKY143 substituídos por alaninas, demonstrou uma severa diminuição na sua capacidade de interagir com MYC e p65/RelA, sugerindo que os resíduos 141KKY143 são importantes para a ligação de ORF73 a MYC e a p65/RelA. Por outro lado, o mutante ORF73138PLP140, com os resíduos 138PLP140 substituídos por alaninas, revelou uma diminuição parcial da sua capacidade de interagir com MYC, tendo permanecido intacta a sua capacidade de interagir com p65/RelA, o que indica que os resíduos 138PLP140 têm um papel na ligação de ORF73 a MYC, mas não na ligação a p65/RelA. Contudo, os mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 comportaram-se da mesma forma nos ensaios de gene repórter, sendo incapazes de activar a actividade transcricional de MYC e apresentando uma diminuição parcial do seu efeito inibitório sobre NF-kB, o que indica que tanto a mutação dos resíduos 141KKY143 como a mutação dos resíduos 138PLP140 afectam a acção modulatória de ORF73 sobre MYC e sobre NF-kB. Os resultados dos ensaios de poli-ubiquitinação mostraram estar de acordo com as observações dos ensaios de gene repórter, uma vez que ambos os mutantes foram incapazes de promover a poli-ubiquitinação de MYC e de p65/RelA, reforçando a ideia de que os resíduos 141KKY143 e 138PLP140 são importantes para a modulação de MYC e de NF-kB pela proteína ORF73. De seguida, a capacidade dos mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 para recrutarem a Elonguina C e a Culina 5, componentes do complexo EC5SORF73, foi avaliada através de experiências de co-imunoprecipitação. Ambos os mutantes recrutaram a Culina 5, mas foram incapazes de recrutar a Elonguina C, comprometendo assim a formação do complexo EC5SORF73 e, consequentemente, suprimindo a função de ligase de ubiquitina de ORF73. O facto de os mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 não conseguirem recrutar a Elonguina C, embora não tivessem mutações no motivo SOCS-box, sugere que as mutações introduzidas nos resíduos 141KKY143 e 138PLP140 tiveram um impacto severo na estrutura tridimensional de ORF73, possivelmente afectando outras funções da proteína viral, como o seu papel putativo na manutenção do epissoma. Este trabalho demonstrou ainda que a actividade de ligase de ubiquitina dos mutantes ORF73141KKY143 e ORF73138PLP140 estava comprometida, à semelhança do que se verificou com o mutante ORF73–SOCS, acima referido. Deste modo, não será possível clarificar, através da utilização destes mutantes em estudos in vivo, a contribuição independente da activação de MYC e da inibição de NF-kB pela proteína viral ORF73, durante a infecção latente de MuHV-4. Portanto, é necessário desenvolver outras estratégias para identificar os motivos de ligação de ORF73 a MYC e a p65/RelA, de modo a tornar possível a construção de mutantes de ORF73 que sejam incapazes de modular cada uma destas proteínas celulares separadamente. A resolução da estrutura tridimensional de ORF73, através de técnicas de cristalografia, pode dar um importante contributo para estes estudos. |
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