Publicação
Development of nanoformulations of pyrazinoic acid prodrugs for treatment of Mycobacterium avium infections
| Resumo: | As micobactérias são bactérias Gram+ cujo diverso número de espécies actualmente descritas (cerca de 130) partilham as mesmas características no que diz respeito à espessura da parede celular e à sua composição única que as torna uma forte barreira à permeabilidade de antibióticos. Algumas destas micobactérias têm um papel preponderante como agentes patogénicos em indivíduos imunocompetentes como acontece com Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae and Mycobacterium ulcerans, os agentes causadores da tuberculose (TB), lepra e úlcera de Buruli, respectivamente. A grande maioria das outras espécies de micobactérias está presente no ambiente como microrganismos saprófitas, podendo alguns ser considerados patogénicos oportunistas e causadores de morte em indivíduos imunocomprometidos. Deste grupo de micobactérias ambientais oportunistas faz parte o complexo Mycobacterium avium (MAC), composto por M. avium, subespécie avium, paratuberculosis, silvaticum, e M. intracellulare, responsável por uma grande percentagem de doenças micobacterianas não tuberculosas (NTM). As infecções provocadas por este complexo são adquiridas através do ambiente, especialmente pela água, solo e alimentos. Apesar da infecção poder ocorrer por inalação a principal via de infecção, especialmente em indivíduos imunocomprometidos, é o tracto gastrointestinal, já que um sistema imunitário imunocompetente consegue controlar estas micobactérias. Os problemas associados aos tratamentos contra M. avium e M. tuberculosis são provocados, entre outras causas, pela incapacidade dos antibióticos atravessarem a parede celular complexa das micobactérias, atingindo concentrações sub-terapêuticas no interior dos macrófagos, local de proliferação das micobactérias. A necessidade de ultrapassar esta desvantagem utilizando doses mais elevadas dá origem ao aparecimento de efeitos tóxicos. Uma vez que os esquemas de tratamento destas infecções são muito longos a adesão á terapia é muitas vezes quebrada contribuindo para o desenvolvimento de resistências à grande maioria dos antibióticos. A pirazinamida (PZA) além de ser um antibiótico de primeira linha no tratamento da TB é um pró-fármaco que requer activação pela enzima pirazinamidase (PZase) para ser transformado em ácido pirazinóico (POA), a sua forma activa. Esta enzima é sintetizada pela própria micobactéria que hidrolisa o pró-fármaco apenas dentro desta. No entanto, esta activação está dependente apenas de uma enzima tendo sido observada a emergência de estirpes resistentes à PZA. A origem destas resistências poderão ser devidas a mutações no gene que codifica a PZase podendo não ocorrer a formação do POA uma vez que a enzima não reconhece o seu substacto. De modo a ultrapassar estes problemas, têm sido investigadas formas alternativas ao uso da PZA. Assim, a síntese de novos pró-fármacos que possam ser activados por esterases micobacterianas e que, em virtude da sua elevada abundância, possam contornar o desenvolvimento de resistências à PZA constitui uma excelente estratégia terapêutica. Nesta linha de investigação, novos pró-fármacos de POA foram investigados por diversos autores tendo demonstrado actividade in vitro superior à PZA contra estirpes de M. tuberculosis, M. avium e M. kansasii. No entanto, estes compostos apresentaram estabilidades reduzidas na presença de fluidos biológicos. Recentemente, no grupo de Química Medicinal da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, foram sintetizados pró-fármacos de amidas e ésteres de POA, com cadeias alcóxido de diferentes tamanhos. Os ésteres de POA apresentaram elevada estabilidade em plasma, particularmente os de cadeia alcóxido longa. Para além disso, estes pró-fármacos são facilmente activados pelas esterases micobacterianas. Estudos in vitro demonstraram que estes ésteres são activos contra estirpes sensíveis de M. tuberculosis em concentrações 10 vezes mais baixas do que as necessárias para a PZA. Na presente dissertação foram desenvolvidas formulações lipossomais de dois ésteres de POA e o seu efeito terapêutico avaliado num modelo murino infectado com uma estirpe de M. avium. A associação destes ésteres aos lipossomas é baseada no facto destes sistemas lipídicos conseguirem contornar os problemas de solubilidade associados a estas moléculas e ainda no facto de, após administração parentérica, poderem atingir o fígado e o baço, os principais orgãos infectados por M. avium. Na primeira parte desta tese foram desenvolvidas e caracterizadas formulações lipossomais de dois ésteres de POA contendo 4 e 12 carbonos na cadeia alquílica linear, designados por C4 e C12. Todas as formulações lipossomais de C12 apresentaram eficácias de incorporação superiores a 90%. No entanto, para as formulações de C4 os valores obtidos foram inferiores a 6% o que pode ser explicado pelo maior carácter lipofílico do C12 em comparação com o C4. Com base nestes resultados, o pró-fármaco C12 foi seleccionado para todos os estudos efectuados a posteriori. Sendo assim, foram preparadas dois tipos de formulações lipossomais: extrusadas e não extrusadas. Os resultados obtidos indicam que a razão final entre o C12 incorporado e o lípido foi superior a 71 nmol/μmol de lípido para todas as suspensões, independentemente do diâmetro e da composição lipídica, o que apoia a hipótese do pró-fármaco estar incorporado na bicamada lipídica. Para fortalecer esta afirmação, foram realizados estudos de calorimetria com lipossomas vazios e com C12 incorporado. Não se observaram alterações nas temperaturas de transição de fase para as duas formulações. No entanto, o aumento de entalpia registado na formulação lipossomal com C12 é o resultado da interacção deste pró-fármaco com as cadeias lipídicas. Estas observações estão relacionadas com o carácter lipofílico do C12, contribuindo para a rigidez do sistema lipossomal e confirmando a sua localização na bicamada lipídica. Na segunda parte deste trabalho foi realizado um estudo sistemático da estabilidade das formulações de C12 na presença de tampão HEPES pH 7.4 e de plasma humano, avaliando a velocidade de hidrólise de C12 e a respectiva formação de POA. Assim, a quantificação destas duas moléculas foi realizada por HPLC, tendo-se procedido previamente à optimização desta metodologia. A estabilidade em tampão foi realizada em duas condições distintas: temperatura ambiente e 37ºC. A evolução do diâmetro das vesículas foi avaliada durante um mês, para garantir a homogeneidade dos lipossomas aquando da sua utilização, não se verificando alterações nestas propriedades para as formulações em estudo. A realização da estabilidade em tampão a 37ºC pretendeu avaliar se a percentagem de C12 incorporado se mantém ao longo de 24 horas. Os resultados obtidos demonstraram uma elevada estabilidade de todos as suspensões relativamente ao pró-fármaco incorporado. Para uma das formulações testadas (DMPC:DSPE-PEG) foi, ainda, analisada a concentração de C12 e a possível formação de POA, tendo-se verificando que o pró-fármaco incorporado não se encontrava na forma hidrolisada. A estabilidade das formulações na presença de plasma humano foi também realizada a 37ºC a fim de avaliar a velocidade de hidrólise do pró-fármaco, na forma livre e lipossomal, em função da composição lipidica, e de modo a estimar o seu comportamento in vivo. Os resultados obtidos indicaram que a hidrólise do C12 foi influenciada principalmente pelo diâmetro médio e rigidez das formulações testadas. De facto, os tempos de semi-vida mais elevados foram obtidos para os lipossomas preparados com fosfolípidos neutros e não submetidos a extrusão. A existência de um elevado número de bicamadas lipídicas que caracterizam estas vesículas está na origem destes resultados. A incubação de C12 na forma livre apresentou uma estabilidade superior comparativamente a algumas formulações, particularmente para as vesículas extrusadas. No entanto, esta estabilidade foi dependente da concentração inicial do pró-fármaco uma vez que, utilizando a dose terapêutica usada no modelo animal infectado com M. avium testado neste trabalho, a velocidade de hidrólise do C12 foi mais lenta nos lipossomas extrusados do que na forma livre. Embora na literatura esteja descrito que as estirpes de M. avium são intrinsecamente resistentes à PZA pretendeu-se avaliar se era possível com este pró-fármaco ultrapassar estas desvantagens tendo em consideração os resultados promissores obtidos in vitro para os ésteres de POA, contra a estirpe de M. tuberculosis. Foi a primeira vez que lipossomas deste pró-fármaco foram testados num modelo murino infectado com M. avium. O estudo preliminar permitiu demonstrar que após administração i.v. do inóculo os principais orgãos infectados são o fígado e o baço. Tendo em consideração estes resultados foi avaliado o efeito terapêutico das diferentes formulações em estudo através da contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) nestes dois orgãos. Paralelamente às formulações de C12 foi também avaliada a actividade terapêutica de POA e PZA na forma livre. Os grupos de animais infectados e não tratados evidenciaram valores de carga bacteriana mais elevados. O maior efeito terapêutico foi observado para os grupos de animais tratados com C12 nas formas livre ou incorporado em lipossomas extrusados, particulamente no fígado. Tendo em consideração que a estirpe de M. avium utilizada neste modelo apresenta uma resistência superior à maioria dos antibióticos comparativamente a algumas estirpes de M. tuberculosis os resultados obtidos são bastante promissores. |
|---|---|
| Autores principais: | Matoso, Mariana Cordeiro, 1989- |
| Assunto: | Pró-fármacos Lipossomas Pirazinamida Teses de mestrado - 2012 |
| Ano: | 2012 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | As micobactérias são bactérias Gram+ cujo diverso número de espécies actualmente descritas (cerca de 130) partilham as mesmas características no que diz respeito à espessura da parede celular e à sua composição única que as torna uma forte barreira à permeabilidade de antibióticos. Algumas destas micobactérias têm um papel preponderante como agentes patogénicos em indivíduos imunocompetentes como acontece com Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae and Mycobacterium ulcerans, os agentes causadores da tuberculose (TB), lepra e úlcera de Buruli, respectivamente. A grande maioria das outras espécies de micobactérias está presente no ambiente como microrganismos saprófitas, podendo alguns ser considerados patogénicos oportunistas e causadores de morte em indivíduos imunocomprometidos. Deste grupo de micobactérias ambientais oportunistas faz parte o complexo Mycobacterium avium (MAC), composto por M. avium, subespécie avium, paratuberculosis, silvaticum, e M. intracellulare, responsável por uma grande percentagem de doenças micobacterianas não tuberculosas (NTM). As infecções provocadas por este complexo são adquiridas através do ambiente, especialmente pela água, solo e alimentos. Apesar da infecção poder ocorrer por inalação a principal via de infecção, especialmente em indivíduos imunocomprometidos, é o tracto gastrointestinal, já que um sistema imunitário imunocompetente consegue controlar estas micobactérias. Os problemas associados aos tratamentos contra M. avium e M. tuberculosis são provocados, entre outras causas, pela incapacidade dos antibióticos atravessarem a parede celular complexa das micobactérias, atingindo concentrações sub-terapêuticas no interior dos macrófagos, local de proliferação das micobactérias. A necessidade de ultrapassar esta desvantagem utilizando doses mais elevadas dá origem ao aparecimento de efeitos tóxicos. Uma vez que os esquemas de tratamento destas infecções são muito longos a adesão á terapia é muitas vezes quebrada contribuindo para o desenvolvimento de resistências à grande maioria dos antibióticos. A pirazinamida (PZA) além de ser um antibiótico de primeira linha no tratamento da TB é um pró-fármaco que requer activação pela enzima pirazinamidase (PZase) para ser transformado em ácido pirazinóico (POA), a sua forma activa. Esta enzima é sintetizada pela própria micobactéria que hidrolisa o pró-fármaco apenas dentro desta. No entanto, esta activação está dependente apenas de uma enzima tendo sido observada a emergência de estirpes resistentes à PZA. A origem destas resistências poderão ser devidas a mutações no gene que codifica a PZase podendo não ocorrer a formação do POA uma vez que a enzima não reconhece o seu substacto. De modo a ultrapassar estes problemas, têm sido investigadas formas alternativas ao uso da PZA. Assim, a síntese de novos pró-fármacos que possam ser activados por esterases micobacterianas e que, em virtude da sua elevada abundância, possam contornar o desenvolvimento de resistências à PZA constitui uma excelente estratégia terapêutica. Nesta linha de investigação, novos pró-fármacos de POA foram investigados por diversos autores tendo demonstrado actividade in vitro superior à PZA contra estirpes de M. tuberculosis, M. avium e M. kansasii. No entanto, estes compostos apresentaram estabilidades reduzidas na presença de fluidos biológicos. Recentemente, no grupo de Química Medicinal da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, foram sintetizados pró-fármacos de amidas e ésteres de POA, com cadeias alcóxido de diferentes tamanhos. Os ésteres de POA apresentaram elevada estabilidade em plasma, particularmente os de cadeia alcóxido longa. Para além disso, estes pró-fármacos são facilmente activados pelas esterases micobacterianas. Estudos in vitro demonstraram que estes ésteres são activos contra estirpes sensíveis de M. tuberculosis em concentrações 10 vezes mais baixas do que as necessárias para a PZA. Na presente dissertação foram desenvolvidas formulações lipossomais de dois ésteres de POA e o seu efeito terapêutico avaliado num modelo murino infectado com uma estirpe de M. avium. A associação destes ésteres aos lipossomas é baseada no facto destes sistemas lipídicos conseguirem contornar os problemas de solubilidade associados a estas moléculas e ainda no facto de, após administração parentérica, poderem atingir o fígado e o baço, os principais orgãos infectados por M. avium. Na primeira parte desta tese foram desenvolvidas e caracterizadas formulações lipossomais de dois ésteres de POA contendo 4 e 12 carbonos na cadeia alquílica linear, designados por C4 e C12. Todas as formulações lipossomais de C12 apresentaram eficácias de incorporação superiores a 90%. No entanto, para as formulações de C4 os valores obtidos foram inferiores a 6% o que pode ser explicado pelo maior carácter lipofílico do C12 em comparação com o C4. Com base nestes resultados, o pró-fármaco C12 foi seleccionado para todos os estudos efectuados a posteriori. Sendo assim, foram preparadas dois tipos de formulações lipossomais: extrusadas e não extrusadas. Os resultados obtidos indicam que a razão final entre o C12 incorporado e o lípido foi superior a 71 nmol/μmol de lípido para todas as suspensões, independentemente do diâmetro e da composição lipídica, o que apoia a hipótese do pró-fármaco estar incorporado na bicamada lipídica. Para fortalecer esta afirmação, foram realizados estudos de calorimetria com lipossomas vazios e com C12 incorporado. Não se observaram alterações nas temperaturas de transição de fase para as duas formulações. No entanto, o aumento de entalpia registado na formulação lipossomal com C12 é o resultado da interacção deste pró-fármaco com as cadeias lipídicas. Estas observações estão relacionadas com o carácter lipofílico do C12, contribuindo para a rigidez do sistema lipossomal e confirmando a sua localização na bicamada lipídica. Na segunda parte deste trabalho foi realizado um estudo sistemático da estabilidade das formulações de C12 na presença de tampão HEPES pH 7.4 e de plasma humano, avaliando a velocidade de hidrólise de C12 e a respectiva formação de POA. Assim, a quantificação destas duas moléculas foi realizada por HPLC, tendo-se procedido previamente à optimização desta metodologia. A estabilidade em tampão foi realizada em duas condições distintas: temperatura ambiente e 37ºC. A evolução do diâmetro das vesículas foi avaliada durante um mês, para garantir a homogeneidade dos lipossomas aquando da sua utilização, não se verificando alterações nestas propriedades para as formulações em estudo. A realização da estabilidade em tampão a 37ºC pretendeu avaliar se a percentagem de C12 incorporado se mantém ao longo de 24 horas. Os resultados obtidos demonstraram uma elevada estabilidade de todos as suspensões relativamente ao pró-fármaco incorporado. Para uma das formulações testadas (DMPC:DSPE-PEG) foi, ainda, analisada a concentração de C12 e a possível formação de POA, tendo-se verificando que o pró-fármaco incorporado não se encontrava na forma hidrolisada. A estabilidade das formulações na presença de plasma humano foi também realizada a 37ºC a fim de avaliar a velocidade de hidrólise do pró-fármaco, na forma livre e lipossomal, em função da composição lipidica, e de modo a estimar o seu comportamento in vivo. Os resultados obtidos indicaram que a hidrólise do C12 foi influenciada principalmente pelo diâmetro médio e rigidez das formulações testadas. De facto, os tempos de semi-vida mais elevados foram obtidos para os lipossomas preparados com fosfolípidos neutros e não submetidos a extrusão. A existência de um elevado número de bicamadas lipídicas que caracterizam estas vesículas está na origem destes resultados. A incubação de C12 na forma livre apresentou uma estabilidade superior comparativamente a algumas formulações, particularmente para as vesículas extrusadas. No entanto, esta estabilidade foi dependente da concentração inicial do pró-fármaco uma vez que, utilizando a dose terapêutica usada no modelo animal infectado com M. avium testado neste trabalho, a velocidade de hidrólise do C12 foi mais lenta nos lipossomas extrusados do que na forma livre. Embora na literatura esteja descrito que as estirpes de M. avium são intrinsecamente resistentes à PZA pretendeu-se avaliar se era possível com este pró-fármaco ultrapassar estas desvantagens tendo em consideração os resultados promissores obtidos in vitro para os ésteres de POA, contra a estirpe de M. tuberculosis. Foi a primeira vez que lipossomas deste pró-fármaco foram testados num modelo murino infectado com M. avium. O estudo preliminar permitiu demonstrar que após administração i.v. do inóculo os principais orgãos infectados são o fígado e o baço. Tendo em consideração estes resultados foi avaliado o efeito terapêutico das diferentes formulações em estudo através da contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) nestes dois orgãos. Paralelamente às formulações de C12 foi também avaliada a actividade terapêutica de POA e PZA na forma livre. Os grupos de animais infectados e não tratados evidenciaram valores de carga bacteriana mais elevados. O maior efeito terapêutico foi observado para os grupos de animais tratados com C12 nas formas livre ou incorporado em lipossomas extrusados, particulamente no fígado. Tendo em consideração que a estirpe de M. avium utilizada neste modelo apresenta uma resistência superior à maioria dos antibióticos comparativamente a algumas estirpes de M. tuberculosis os resultados obtidos são bastante promissores. |
|---|