Publicação

Enhancing reprogramming and transdifferentiation through long non-coding RNAs

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Foi recentemente desenvolvido um novo método revolucionário capaz de reprogramar fibroblastos em células pluripotentes induzidas através da expressão de 4 fatores de transcrição (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc). A reprogramação de fibroblastos em células pluripotentes induzidas (iPSC) foi um grande avanço científico com possíveis aplicações clínicas e fins terapêuticos, no entanto, à medida que as células diferenciadas (células somáticas) vão envelhecendo devido à acumulação de marcas genéticas e epigenéticas, estas tornam-se mais resistentes à sua conversão para um estado pluripotente. Posto isto, um dos principais objetivos deste projeto passava por perceber o impacto que o envelhecimento tem na reprogramação de células humanas em células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs). De facto, ao reprogramar fibroblastos adultos de ratinho em células pluripotentes induzidas (miPSCs – mouse induced pluripotent stem cells), observou-se que o envelhecimento celular estava a atuar como uma barreira, reduzindo a eficiência da reprogramação celular. Curiosamente, nenhuma correlação entre a eficiência da reprogramação celular e o envelhecimento foi observada na reprogramação de células humanas. Ao realizar a reprogramação celular de fibroblastos embrionários humanos (WI38) e fibroblastos humanos com 3 anos (3yr) com baixa passagem (passage 4), observou-se o mesmo número de células hiPSCs geradas. Sugerindo assim, e ao contrário do esperado e observado em células de ratinho, que a idade das células humanas utilizadas para formar hiPSCs não dificulta de forma significativa a reprogramação celular. Contudo, foi observado que o número de passagens das células em cultura tinha uma contribuição importante na eficiência da reprogramação celular de fibroblastos humanos em hiPSCs. Ao tentar reprogramar fibroblastos humanos com uma baixa passagem (passagem 4) e uma alta passagem (passagem 7), e apesar de as células com passagem 7 expressarem níveis mais elevados de hOCt4, apenas as células humanas com uma baixa passagem reprogramaram. Estes resultados sugerem que o número de passagens celulares tem uma contribuição importante na eficiência da reprogramação celular. De facto, estes resultados podem ser explicados pela simples razão de que cada passagem celular realizada em cultura, aumenta o risco de ocorrer dano no ADN, mutações e ainda alterações nas características celulares originando assim, alterações na morfologia, na resposta a estímulos, na taxa de crescimento, na expressão de proteínas e na eficiência da transfecção celular. De acordo com Leonard Hayflick e Paul Moorhead, as células humanas têm um número limitado de divisões celulares em cultura que poderá variar entre tipos de células. Cada divisão celular pode induzir um encurtamento dos telómeros que poderá resultar em senescência. Podendo esta ser ainda induzida através de dano molecular que ocorre de forma aleatória, pelo stress oxidativo e pela danificação do ADN. A senescência pode ainda ser acumulada em alguns tecidos contribuindo para a disfunção orgânica. Sugere-se portanto, que devido ao número elevado de passagens celulares, os fibroblastos embrionários humanos e os fibroblastos humanos com 3 anos sofreram o encurtamento dos seus telomeros, levando assim, a um fenótipo senescente, reduzindo a eficiência do processo de reprogramação celular em células humanas. Um outro objetivo deste projeto passava por encontrar outras estratégias celulares que ajudem a ultrapassar a limitação do envelhecimento na reprogramação celular de células humanas, através da modulação de RNAs longos não codificantes (lncRNA). No entanto, como os resultados referentes ao envelhecimento demonstraram uma não influência na eficiência da reprogramação de células humanas em hiPSCs, decidiu-se desvendar e entender, qual a função do lncRNA Zeb2NAT na reprogramação celular e qualidade de células humanas. Embora, já reportado anteriormente pelo nosso laboratório, que a supressão do lncRNA Zeb2NAT em células de ratinho, utilizando olignucleótidos contra-senso (anti sense), denominados por LNAs aumentam significativamente a reprogramação celular de fibroblastos de ratinho envelhecidos ajudando assim contornar as barreiras mesenquimais, ainda nada se sabia sobre o impacto que a diminuição do Zeb2 e do Zeb2NAT poderia ter na reprogramação celular de células humanas. Contudo, utilizando a mesma abordagem, acima descrita, em fibroblastos embrionários humanos e em fibroblastos humanos com 3 anos, verificou-se um atraso na formação de hiPSCs das células humanas que sofreram uma desregulação tanto do Zeb2 como do Zeb2NAT, comparativamente às células do controlo e do LNA-controlo (um LNA não específico a nenhuma sequência genómica humana, utilizado como um controlo negativo da transfeção de LNAs). De facto, 14 dias após a primeira transfeção com LNAs em ambas as duas linhas celulares, apenas começaram a formar-se hiPSCs no controlo e no LNA-controlo, tendo o controlo um número maior de hiPSCs formadas em ambas as células, comparativamente à condição com LNA-controlo. No entanto, 19 dias e 35 dias depois da primeira transfeção, as WI38 com a desregulação do Zeb2 e do Zeb2NAT, respetivamente, começaram a reprogramar. Nenhuma formação de hiPSCs nas células humanas de 3 anos com a desregulação do Zeb2 e do Zeb2NAT foi observada. Tendo em consideração que as células de ratinho após diminuição dos níveis do Zeb2 e do Zeb2-NAT começaram a reprogramar de forma mais eficiente que o controlo e o LNA-controlo, estes resultados em células humanas sugerem que a desregulação do Zeb2 e do Zeb2NAT pode estar, de certa maneira, a atrasar e até mesmo a atuar como um bloqueador da reprogramação celular humana. Este bloqueio/atraso que se observou na reprogramação de fibroblastos humanos em hiPSCs poderia ter como principal responsável a transfeção de LNAs, necessária para diminuir a expressão do Zeb2 e do Zeb2NAT. De facto, já foi demonstrado que o uso do reagente de transfeção Lipofectamine ativa algum stress nos genes afetando o ciclo da regulação e/ou a sinalização metabólica nas células. No entanto, as células com a condição do LNA-controlo reprogramaram com a mesma rapidez que o controlo (sem LNAs). E a diferença do número de hiPSCs geradas pelo LNA-controlo, comparativamente ao controlo, acaba por não ser significativamente diferente. Isto sugere, que embora a transfeção de LNAs tenha um impacto na reprogramação celular, diminuindo a eficiência desta, existe um outro fator que está a contribuir para que as células com a diminuição da expressão do Zeb2 e do Zeb2-NAT tenham uma redução na eficiência da reprogramação celular em células humanas. Todavia, ainda é incerto a razão de a desregulação do Zeb2 e do Zeb2NAT terem atrasado e até mesmo bloqueado a reprogramação celular em células humanas. É possível que possa ser devido ao mecanismo que rege o Zeb2 que, de alguma forma, é diferente comparativamente ao mecanismo observado em ratinhos. Outra possibilidade a ter em conta é a necessidade de realizar uma otimização ao protocolo da transfeção de LNAs, de forma a adaptar esta ao protocolo da reprogramação celular. Apesar disto, acreditamos que esta abordagem constitui uma nova estratégia para estudar o impacto dos lncRNAs na reprogramação celular e antecipamos ainda que os resultados produzidos irão gerar contribuições importantes na área de investigação do envelhecimento e da reprogramação celular.
Autores principais:	Santana, Miguel Torres
Assunto:	Reprogramação celular Fibroblastos humanos Células estaminais pluripotentes induzidas humanas Envelhecimento Zeb2NAT Teses de mestrado - 2017
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Foi recentemente desenvolvido um novo método revolucionário capaz de reprogramar fibroblastos em células pluripotentes induzidas através da expressão de 4 fatores de transcrição (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc). A reprogramação de fibroblastos em células pluripotentes induzidas (iPSC) foi um grande avanço científico com possíveis aplicações clínicas e fins terapêuticos, no entanto, à medida que as células diferenciadas (células somáticas) vão envelhecendo devido à acumulação de marcas genéticas e epigenéticas, estas tornam-se mais resistentes à sua conversão para um estado pluripotente. Posto isto, um dos principais objetivos deste projeto passava por perceber o impacto que o envelhecimento tem na reprogramação de células humanas em células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs). De facto, ao reprogramar fibroblastos adultos de ratinho em células pluripotentes induzidas (miPSCs – mouse induced pluripotent stem cells), observou-se que o envelhecimento celular estava a atuar como uma barreira, reduzindo a eficiência da reprogramação celular. Curiosamente, nenhuma correlação entre a eficiência da reprogramação celular e o envelhecimento foi observada na reprogramação de células humanas. Ao realizar a reprogramação celular de fibroblastos embrionários humanos (WI38) e fibroblastos humanos com 3 anos (3yr) com baixa passagem (passage 4), observou-se o mesmo número de células hiPSCs geradas. Sugerindo assim, e ao contrário do esperado e observado em células de ratinho, que a idade das células humanas utilizadas para formar hiPSCs não dificulta de forma significativa a reprogramação celular. Contudo, foi observado que o número de passagens das células em cultura tinha uma contribuição importante na eficiência da reprogramação celular de fibroblastos humanos em hiPSCs. Ao tentar reprogramar fibroblastos humanos com uma baixa passagem (passagem 4) e uma alta passagem (passagem 7), e apesar de as células com passagem 7 expressarem níveis mais elevados de hOCt4, apenas as células humanas com uma baixa passagem reprogramaram. Estes resultados sugerem que o número de passagens celulares tem uma contribuição importante na eficiência da reprogramação celular. De facto, estes resultados podem ser explicados pela simples razão de que cada passagem celular realizada em cultura, aumenta o risco de ocorrer dano no ADN, mutações e ainda alterações nas características celulares originando assim, alterações na morfologia, na resposta a estímulos, na taxa de crescimento, na expressão de proteínas e na eficiência da transfecção celular. De acordo com Leonard Hayflick e Paul Moorhead, as células humanas têm um número limitado de divisões celulares em cultura que poderá variar entre tipos de células. Cada divisão celular pode induzir um encurtamento dos telómeros que poderá resultar em senescência. Podendo esta ser ainda induzida através de dano molecular que ocorre de forma aleatória, pelo stress oxidativo e pela danificação do ADN. A senescência pode ainda ser acumulada em alguns tecidos contribuindo para a disfunção orgânica. Sugere-se portanto, que devido ao número elevado de passagens celulares, os fibroblastos embrionários humanos e os fibroblastos humanos com 3 anos sofreram o encurtamento dos seus telomeros, levando assim, a um fenótipo senescente, reduzindo a eficiência do processo de reprogramação celular em células humanas. Um outro objetivo deste projeto passava por encontrar outras estratégias celulares que ajudem a ultrapassar a limitação do envelhecimento na reprogramação celular de células humanas, através da modulação de RNAs longos não codificantes (lncRNA). No entanto, como os resultados referentes ao envelhecimento demonstraram uma não influência na eficiência da reprogramação de células humanas em hiPSCs, decidiu-se desvendar e entender, qual a função do lncRNA Zeb2NAT na reprogramação celular e qualidade de células humanas. Embora, já reportado anteriormente pelo nosso laboratório, que a supressão do lncRNA Zeb2NAT em células de ratinho, utilizando olignucleótidos contra-senso (anti sense), denominados por LNAs aumentam significativamente a reprogramação celular de fibroblastos de ratinho envelhecidos ajudando assim contornar as barreiras mesenquimais, ainda nada se sabia sobre o impacto que a diminuição do Zeb2 e do Zeb2NAT poderia ter na reprogramação celular de células humanas. Contudo, utilizando a mesma abordagem, acima descrita, em fibroblastos embrionários humanos e em fibroblastos humanos com 3 anos, verificou-se um atraso na formação de hiPSCs das células humanas que sofreram uma desregulação tanto do Zeb2 como do Zeb2NAT, comparativamente às células do controlo e do LNA-controlo (um LNA não específico a nenhuma sequência genómica humana, utilizado como um controlo negativo da transfeção de LNAs). De facto, 14 dias após a primeira transfeção com LNAs em ambas as duas linhas celulares, apenas começaram a formar-se hiPSCs no controlo e no LNA-controlo, tendo o controlo um número maior de hiPSCs formadas em ambas as células, comparativamente à condição com LNA-controlo. No entanto, 19 dias e 35 dias depois da primeira transfeção, as WI38 com a desregulação do Zeb2 e do Zeb2NAT, respetivamente, começaram a reprogramar. Nenhuma formação de hiPSCs nas células humanas de 3 anos com a desregulação do Zeb2 e do Zeb2NAT foi observada. Tendo em consideração que as células de ratinho após diminuição dos níveis do Zeb2 e do Zeb2-NAT começaram a reprogramar de forma mais eficiente que o controlo e o LNA-controlo, estes resultados em células humanas sugerem que a desregulação do Zeb2 e do Zeb2NAT pode estar, de certa maneira, a atrasar e até mesmo a atuar como um bloqueador da reprogramação celular humana. Este bloqueio/atraso que se observou na reprogramação de fibroblastos humanos em hiPSCs poderia ter como principal responsável a transfeção de LNAs, necessária para diminuir a expressão do Zeb2 e do Zeb2NAT. De facto, já foi demonstrado que o uso do reagente de transfeção Lipofectamine ativa algum stress nos genes afetando o ciclo da regulação e/ou a sinalização metabólica nas células. No entanto, as células com a condição do LNA-controlo reprogramaram com a mesma rapidez que o controlo (sem LNAs). E a diferença do número de hiPSCs geradas pelo LNA-controlo, comparativamente ao controlo, acaba por não ser significativamente diferente. Isto sugere, que embora a transfeção de LNAs tenha um impacto na reprogramação celular, diminuindo a eficiência desta, existe um outro fator que está a contribuir para que as células com a diminuição da expressão do Zeb2 e do Zeb2-NAT tenham uma redução na eficiência da reprogramação celular em células humanas. Todavia, ainda é incerto a razão de a desregulação do Zeb2 e do Zeb2NAT terem atrasado e até mesmo bloqueado a reprogramação celular em células humanas. É possível que possa ser devido ao mecanismo que rege o Zeb2 que, de alguma forma, é diferente comparativamente ao mecanismo observado em ratinhos. Outra possibilidade a ter em conta é a necessidade de realizar uma otimização ao protocolo da transfeção de LNAs, de forma a adaptar esta ao protocolo da reprogramação celular. Apesar disto, acreditamos que esta abordagem constitui uma nova estratégia para estudar o impacto dos lncRNAs na reprogramação celular e antecipamos ainda que os resultados produzidos irão gerar contribuições importantes na área de investigação do envelhecimento e da reprogramação celular.