Publicação

Fatty acids and lipid signaling in grapevine resistance to Plasmopara viticola

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A videira (Vitis vinifera L.) é a uma das plantas mais cultivadas em todo o mundo, com mais de 7.5 milhões de hectares de produção, a nível mundial. Foram identificadas mais de 70 espécies de Vitis, mas apenas a Vitis vinifera é utilizada para a produção de vinho, que por si só tem um mercado tão vasto que em 2016 gerou mais de 29 mil milhões de euros. Portugal é um dos maiores produtores e exportadores de vinho do mundo, posicionando-se em décimo primeiro lugar no ranking mundial dos países produtores de vinho. A cultura vinícola portuguesa é riquíssima, contando com mais de 250 variedades nacionais, o que torna a nossa indústria vinícola uma das mais conceituadas e apreciadas no mundo. Contudo a grande maioria das cultivares de Vitis vinifera utilizadas na indústria vinícola apresenta uma elevada suscetibilidade à doença míldio. O míldio da videira é causado pelo Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni, um oomycete obrigatório, que foi introduzido na Europa no final do século XIX, através de enxertos de videiras provenientes da América, que eram utilizados para replantar as videiras afetadas por uma praga causada por filoxera. O míldio da videira é uma das epidemias mais severas em culturas de videira, podendo numa única época devastar culturas inteiras, reduzindo a qualidade das uvas e afetando também a do vinho produzido, o que consequentemente leva a enormes perdas económicas. O modo de infeção do P. viticola, requer um conjunto de condições favoráveis, como temperatura moderada (21-25ºC) e humidade elevada (>75%). Quando estas condições estão reunidas, os oósporos germinam, originado zoosporângios que libertam zoósporos que migram até ao estoma onde germinam e atravessam a cavidade estomática, de forma a desenvolver as hifas primárias e o micélio. No espaço intercelular do mesófilo ocorre a diferenciação das hifas primárias no haustório, que é uma estrutura especializada que permite que o oomycete obtenha nutrientes, suprima os mecanismos de defesa e redirecione o metabolismo do hospedeiro a seu favor. Em videiras suscetíveis, formam-se as manchas de óleo características e o desenvolvimento dos esporangióforos que após emergir através do estoma, libertam os esporângios, sendo estes dispersos até tecidos hospedeiros, como folhas, frutos ou ramos, podendo originar infeções secundárias. De forma a controlar esta doença, os viticultores recorrem ao uso preventivo de fitoquímicos durante toda a época de cultivo, o que acarreta elevados custos económicos e ambientais. Uma abordagem alternativa, visando a sustentabilidade da viticultura passa pela criação de videiras hibridas resultantes do cruzamento de Vitis americanas ou asiáticas, que possuem resistência ou tolerância ao P. viticola, com variedades de Vitis com boa qualidade para a indústria vinícola. Contudo, o processo de seleção de uma videira hibrida é bastante trabalhoso e demorado, sendo necessários 2 a 3 anos até que seja possível identificar plantas que contenham as características desejadas. O objetivo principal deste trabalho é a compreensão de como se processam os mecanismos de defesa bem como quais as alterações que as videiras resistentes apresentam no combate ao míldio. Nos últimos anos, vários estudos têm sido efetuados na área das ómicas (transcritómica, proteómica e metabolómica). Estas análises permitiram identificar diferenças entre genótipos de videira resistentes/tolerantes e suscetíveis ao P. viticola, nomeadamente associadas aos mecanismos de perceção do patogénio, cascatas de sinalização e sinalização por lípidos. Na sinalização por lípidos, foi demonstrada a participação do ácido jasmónico (JA) na resposta de defesa a este patogénio biotrófico e o envolvimento de lípidos membranares. Os lípidos membranares não só têm uma função estrutural, como também estão envolvidos nos mecanismos de defesa das plantas. Em situações de stress e sob ação de fosfolipases, os lípidos de membrana fornecem substratos para a formação de moléculas de sinalização tais como os ácidos gordos (FA) livres, ácido fosfatídico, inositol trifosfato (IP3), oxilipinas entre outros. A fosfolipase A (PLA) é um importante enzima que tem a sua atividade aumentada em situações de resposta a agentes patogénicos, levando à hidrólise de fosfolípidos presentes nas membranas. Destas reações de hidrólise são libertadas diversas moléculas, que desempenham funções de sinalização ou servem de substratos para a biossíntese de moléculas de sinalização, como o JA. No âmbito deste trabalho foram englobadas três vertentes, análise da modulação dos ácidos gordos e lípidos, bioinformática e transcritómica. O perfil de ácidos gordos e lípidos de dois genótipos de Vitis vinifera com diferente tolerância ao P. viticola foi caracterizado por cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia gasosa (GC). As cultivares de Vitis vinifera, Regent (resistente) e Trincadeira (suscetível) são constitutivamente diferentes, no que diz respeito à composição lipídica e de conteúdo em FA. Após inoculação com P. viticola, a cultivar resistente apresenta uma modelação do conteúdo em ácidos gordos não observável na cultivar suscetível, nomeadamente uma acumulação de ácido α-linolénico (C18:3) bem como um aumento do rácio de ácidos gordos insaturados e saturados, refletindo-se numa maior fluidez das membranas celulares. As maiores alterações do conteúdo em ácidos gordos ocorreram às 6h após inoculação, pelo que selecionámos este momento para uma avaliação mais detalhada da modulação das diferentes classes lipídicas. Em Regent foi observada uma diminuição dos lípidos de membrana, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), dos ácidos gordos livres bem como nos lípidos de reserva, triacilglicerol (TAG). Por outro lado, os lípidos cloroplastidiais, mono e di-galactosil diacilglicerol (MGDG, DGDG) e fosfatidilglicerol (PG), aumentam com a inoculação,nomeadamente no seu conteúdo em C18:3. As fosfolipases A hidrolisam lípidos membranares e já foram associadas à biossíntese de JA. Com o objetivo de uma melhor compreensão das vias metabólicas, associadas às alterações lipídicas observadas no genótipo resistente, sobretudo associado ao JA, focámos o nosso estudo nesta família. Conduzimos uma análise bioinformática para identificar e caracterizar os membros desta família em V. vinifera. Identificámos 41 genes, localizados em 9 dos 19 cromossomas da videira, que codificam proteínas que se distribuem em três grandes classes, fosfolipase A1 (PLA1), fosfolipase A2 secretora (sPLA2) e fosfolipase A de tipo patatina (pPLA), de acordo com a homologia de sequência. Alguns genes foram selecionados para uma análise de expressão por PCR em tempo real (qPCR) em Vitis vinifera cv. Regent inoculada com P. viticola. Os resultados obtidos demostraram que a maioria dos genes selecionados apresenta aumento de expressão, sobretudo nas primeiras horas de infeção. Um dos ácidos gordos libertados por estas enzimas é o C18:3, que é o precursor biossintético do JA, facto corroborado por uma acumulação significativa de JA, bem como a sua forma ativa JA-isoleucina (JA-Ile), às 12 horas após a infeção com o P. viticola previamente descrita para genótipo resistente, Regent. Os nossos resultados demonstraram também que o perfil de ácidos gordos permite discriminar ambos os genótipos, Regent e Trincadeira, antes da infeção com o P. viticola. De forma a avaliar se as diferenças constitutivas observadas poderão servir como biomarcadores de resistência a este patogénio, analisou-se o conteúdo em FA de várias espécies resistentes/tolerantes de videira (V. Riparia, V. Labrusca, V. Rupestris, V. Rotundifolia, V. Candicans, V. Sylvesteris e V. vinifera cv. Regent) e cultivares suscetíveis de Vitis vinifera (V. vinifera cv. Pinot noir, Trincadeira e Cabernet Sauvignon). Os nossos resultados apontam para a existência de um padrão discriminatório entre as videiras resistentes/tolerantes e suscetíveis, ao P. viticola, sobretudo ao nível dos FA insaturados, nos quais se observa uma menor quantidade de ácido oleico e linoleico (C18:1 e C18:2) e uma maior quantidade em C18:3 nas espécies de videira resistentes/tolerantes.
Autores principais:	Laureano, Gonçalo Miguel Mendes Pais Costa
Assunto:	Vitis vinifera Plasmopara viticola Fosfolipase A Sinalização lipídica Ácido jasmónico Teses de mestrado - 2018
Ano:	2018
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A videira (Vitis vinifera L.) é a uma das plantas mais cultivadas em todo o mundo, com mais de 7.5 milhões de hectares de produção, a nível mundial. Foram identificadas mais de 70 espécies de Vitis, mas apenas a Vitis vinifera é utilizada para a produção de vinho, que por si só tem um mercado tão vasto que em 2016 gerou mais de 29 mil milhões de euros. Portugal é um dos maiores produtores e exportadores de vinho do mundo, posicionando-se em décimo primeiro lugar no ranking mundial dos países produtores de vinho. A cultura vinícola portuguesa é riquíssima, contando com mais de 250 variedades nacionais, o que torna a nossa indústria vinícola uma das mais conceituadas e apreciadas no mundo. Contudo a grande maioria das cultivares de Vitis vinifera utilizadas na indústria vinícola apresenta uma elevada suscetibilidade à doença míldio. O míldio da videira é causado pelo Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni, um oomycete obrigatório, que foi introduzido na Europa no final do século XIX, através de enxertos de videiras provenientes da América, que eram utilizados para replantar as videiras afetadas por uma praga causada por filoxera. O míldio da videira é uma das epidemias mais severas em culturas de videira, podendo numa única época devastar culturas inteiras, reduzindo a qualidade das uvas e afetando também a do vinho produzido, o que consequentemente leva a enormes perdas económicas. O modo de infeção do P. viticola, requer um conjunto de condições favoráveis, como temperatura moderada (21-25ºC) e humidade elevada (>75%). Quando estas condições estão reunidas, os oósporos germinam, originado zoosporângios que libertam zoósporos que migram até ao estoma onde germinam e atravessam a cavidade estomática, de forma a desenvolver as hifas primárias e o micélio. No espaço intercelular do mesófilo ocorre a diferenciação das hifas primárias no haustório, que é uma estrutura especializada que permite que o oomycete obtenha nutrientes, suprima os mecanismos de defesa e redirecione o metabolismo do hospedeiro a seu favor. Em videiras suscetíveis, formam-se as manchas de óleo características e o desenvolvimento dos esporangióforos que após emergir através do estoma, libertam os esporângios, sendo estes dispersos até tecidos hospedeiros, como folhas, frutos ou ramos, podendo originar infeções secundárias. De forma a controlar esta doença, os viticultores recorrem ao uso preventivo de fitoquímicos durante toda a época de cultivo, o que acarreta elevados custos económicos e ambientais. Uma abordagem alternativa, visando a sustentabilidade da viticultura passa pela criação de videiras hibridas resultantes do cruzamento de Vitis americanas ou asiáticas, que possuem resistência ou tolerância ao P. viticola, com variedades de Vitis com boa qualidade para a indústria vinícola. Contudo, o processo de seleção de uma videira hibrida é bastante trabalhoso e demorado, sendo necessários 2 a 3 anos até que seja possível identificar plantas que contenham as características desejadas. O objetivo principal deste trabalho é a compreensão de como se processam os mecanismos de defesa bem como quais as alterações que as videiras resistentes apresentam no combate ao míldio. Nos últimos anos, vários estudos têm sido efetuados na área das ómicas (transcritómica, proteómica e metabolómica). Estas análises permitiram identificar diferenças entre genótipos de videira resistentes/tolerantes e suscetíveis ao P. viticola, nomeadamente associadas aos mecanismos de perceção do patogénio, cascatas de sinalização e sinalização por lípidos. Na sinalização por lípidos, foi demonstrada a participação do ácido jasmónico (JA) na resposta de defesa a este patogénio biotrófico e o envolvimento de lípidos membranares. Os lípidos membranares não só têm uma função estrutural, como também estão envolvidos nos mecanismos de defesa das plantas. Em situações de stress e sob ação de fosfolipases, os lípidos de membrana fornecem substratos para a formação de moléculas de sinalização tais como os ácidos gordos (FA) livres, ácido fosfatídico, inositol trifosfato (IP3), oxilipinas entre outros. A fosfolipase A (PLA) é um importante enzima que tem a sua atividade aumentada em situações de resposta a agentes patogénicos, levando à hidrólise de fosfolípidos presentes nas membranas. Destas reações de hidrólise são libertadas diversas moléculas, que desempenham funções de sinalização ou servem de substratos para a biossíntese de moléculas de sinalização, como o JA. No âmbito deste trabalho foram englobadas três vertentes, análise da modulação dos ácidos gordos e lípidos, bioinformática e transcritómica. O perfil de ácidos gordos e lípidos de dois genótipos de Vitis vinifera com diferente tolerância ao P. viticola foi caracterizado por cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia gasosa (GC). As cultivares de Vitis vinifera, Regent (resistente) e Trincadeira (suscetível) são constitutivamente diferentes, no que diz respeito à composição lipídica e de conteúdo em FA. Após inoculação com P. viticola, a cultivar resistente apresenta uma modelação do conteúdo em ácidos gordos não observável na cultivar suscetível, nomeadamente uma acumulação de ácido α-linolénico (C18:3) bem como um aumento do rácio de ácidos gordos insaturados e saturados, refletindo-se numa maior fluidez das membranas celulares. As maiores alterações do conteúdo em ácidos gordos ocorreram às 6h após inoculação, pelo que selecionámos este momento para uma avaliação mais detalhada da modulação das diferentes classes lipídicas. Em Regent foi observada uma diminuição dos lípidos de membrana, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), dos ácidos gordos livres bem como nos lípidos de reserva, triacilglicerol (TAG). Por outro lado, os lípidos cloroplastidiais, mono e di-galactosil diacilglicerol (MGDG, DGDG) e fosfatidilglicerol (PG), aumentam com a inoculação,nomeadamente no seu conteúdo em C18:3. As fosfolipases A hidrolisam lípidos membranares e já foram associadas à biossíntese de JA. Com o objetivo de uma melhor compreensão das vias metabólicas, associadas às alterações lipídicas observadas no genótipo resistente, sobretudo associado ao JA, focámos o nosso estudo nesta família. Conduzimos uma análise bioinformática para identificar e caracterizar os membros desta família em V. vinifera. Identificámos 41 genes, localizados em 9 dos 19 cromossomas da videira, que codificam proteínas que se distribuem em três grandes classes, fosfolipase A1 (PLA1), fosfolipase A2 secretora (sPLA2) e fosfolipase A de tipo patatina (pPLA), de acordo com a homologia de sequência. Alguns genes foram selecionados para uma análise de expressão por PCR em tempo real (qPCR) em Vitis vinifera cv. Regent inoculada com P. viticola. Os resultados obtidos demostraram que a maioria dos genes selecionados apresenta aumento de expressão, sobretudo nas primeiras horas de infeção. Um dos ácidos gordos libertados por estas enzimas é o C18:3, que é o precursor biossintético do JA, facto corroborado por uma acumulação significativa de JA, bem como a sua forma ativa JA-isoleucina (JA-Ile), às 12 horas após a infeção com o P. viticola previamente descrita para genótipo resistente, Regent. Os nossos resultados demonstraram também que o perfil de ácidos gordos permite discriminar ambos os genótipos, Regent e Trincadeira, antes da infeção com o P. viticola. De forma a avaliar se as diferenças constitutivas observadas poderão servir como biomarcadores de resistência a este patogénio, analisou-se o conteúdo em FA de várias espécies resistentes/tolerantes de videira (V. Riparia, V. Labrusca, V. Rupestris, V. Rotundifolia, V. Candicans, V. Sylvesteris e V. vinifera cv. Regent) e cultivares suscetíveis de Vitis vinifera (V. vinifera cv. Pinot noir, Trincadeira e Cabernet Sauvignon). Os nossos resultados apontam para a existência de um padrão discriminatório entre as videiras resistentes/tolerantes e suscetíveis, ao P. viticola, sobretudo ao nível dos FA insaturados, nos quais se observa uma menor quantidade de ácido oleico e linoleico (C18:1 e C18:2) e uma maior quantidade em C18:3 nas espécies de videira resistentes/tolerantes.