Publicação

Establishment of neural circuits during zebrafish development: characterization and optimization of imaging conditions

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O peixe-zebra (Danio rerio) é um peixe de água doce da família dos ciprinídeos. Em neurociência, o uso do peixe-zebra como modelo tem vindo a aumentar, pois este apresenta um padrão anatómico e circuitos neuronais semelhantes à maioria dos vertebrados. Para além disso, a sua transparência natural em estados lavares permite a imagiologia do cérebro in vivo. Devido à sua corrente popularidade, existem várias ferramentas genéticas disponíveis que permitem a criação de linhas transgénicas estáveis. No peixe-zebra, o desenvolvimento do cérebro ocorre num curto período de tempo. A neurogénese inicia-se por volta das 10 horas após fertilização (hpf), ainda durante a gastrulação. Nesta etapa forma-se um modelo primário da rede neuronal. A axogénese destes neurónios inicia-se entre as 14 e 24 hpf. A neurogénese secundária, expande a rede neuronal primária, não existindo separação temporal clara entre as duas fases. Durante o 1º dpf o tubo neural é formado e sofre morfogénese regional criando 10 neurómeros entre o prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo. Esta regionalização (rostro-caudal e dorso-ventral) contribui para o desenvolvimento dos vários subtipos de neurónios e células gliais uma vez que fornece gradientes de fatores parácrinos e sinais celulares. Assim, no final do 1º dpf, os embriões já apresentam contrações musculares espontâneas, ao 2º dia de desenvolvimento os embriões respondem ao toque e no final da primeira semana de desenvolvimento, as larvas exibem um conjunto de comportamentos inatos, entre os quais os comportamentos visualmente-guiados. Os comportamentos visualmente-guiados são comportamentos exibidos naturalmente pelas larvas do peixe-zebra e podem ser controlados em laboratório. A resposta optocinética é um movimento reflexivo do olho que permite que o organismo siga um estímulo rotativo. A resposta optomotora é uma adaptação do comportamento natatório a uma mudança percecionada no movimento da água. Para compreender como o cérebro controla estes comportamentos é importante identificar os circuitos que estão por detrás destes e isto é possível com a criação de linhas transgénicas. As linhas transgénicas aqui referidas foram geradas pelo Orger Lab (Fundação Champalimaud – Centre for the Unknown) através da introdução por transgénese mediada por transposão de um fragmento genético de peixe-zebra. O fragmento genético introduzido contém um gene de interesse, que se sabe previamente que tem expressão em certas populações neuronais. Associado ao primeiro codão deste gene de interesse está o GFF (derivado de Gal4). Por cruzamento destas linhas transgénicas com uma linha UAS:GFP, é possível exprimir o repórter (GFP – Green Fluorescent Protein) nas populações neuronais onde o gene de interesse é naturalmente expresso. Após imagiologia, é necessário atribuir a cada estrutura uma região cerebral num processo chamado de caracterização anatómica. Neste momento, vários atlas digitais e bases de dados do cérebro do peixe-zebra têm sido desenvolvidos para o estádio de 6 dpf, como o Z-Brain, Zebrafish Brain Browser e o Mas-Planck Zebrafish Brain Atlas. No entanto, para estádios mais precoces de desenvolvimento, apenas tentativas parciais foram realizadas. Desta forma, os objetivos desta dissertação são: caracterizar anatomicamente duas linhas transgénicas (Tg(Pitx2c:GFF) e TgBAC(sst1:GFF) geradas pelo Orger Lab) e explorar marcações de contraste e posições de montagem adequadas para o estudo dos estágios de desenvolvimento precoces em peixe-zebra. As imagens da caracterização anatómica foram adquiridas através de microscopia confocal após um tratamento imunohistoquímico e de seguida submetidas a análise de imagem e caracterização anatómica. Por comparação visual com bibliografia, atlas e bases de dados previamente descritos, a caracterização anatómica foi efetuada, identificando estruturas cerebrais no prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo. Na caracterização anatómica, ambas as linhas mostraram expressão de GFP desde o 1º dpf até ao 6º dpf. Nos primeiros dias de desenvolvimento a expressão é, no geral, mais fraca, sendo que a sua distribuição espacial e nível de expressão aumentam com o passar do tempo. O padrão de expressão de GFP parece ser estabelecido em torno do 3º e 4º dpf. Após estes estágios, o padrão espacial mantém-se verificando-se apenas o crescimento em número de células até aos 6 dpf. O gene Pitx2c codifica um fator de transcrição. A linha Tg(Pitx2c:GFF) tem expressão de GFP em regiões cujo gene – Pitx2c – já tinha mostrado expressão prévia. Entre as quais, destaca-se a assimetria encontrada no diencéfalo (mais propriamente no epitálamo), a expressão no núcleo do fascículo longitudinal medial (nMLF), no núcleo oculomotor e na retina. Todas estas estruturas anatómicas estão envolvidas nos circuitos que formam os comportamentos de resposta optocinética e optomotora. O gene sst1 codifica o neurotransmissor de somatostatina. A linha TgBAC(sst1:GFF) também apresenta expressão em estruturas previamente descritas com expressão do gene, como o cerebelo. Outras regiões, como epitálamo, pálio, sub-pálio e núcleo interpeduncular também foram aqui verificadas. Estas estruturas, encontram-se associadas às redes neuronais que levam aos comportamentos visualmente-guiados. Devido ao facto dos atlas e bases de dados do cérebro do peixe-zebra se focarem sobretudo em estádios de desenvolvimento mais avançados, não existe ainda um protocolo otimizado para a imagiologia destas amostras quer em termos de marcação de contraste, quer em termos de montagem entre lâmina e lamela. Aqui, tentou-se explorar algumas alternativas a estes casos. O tERK é um anticorpo usado por vários atlas digitais como marcação de contraste. Contudo, e apesar de ser uma boa marcação para estádios mais avançados de desenvolvimento (como os 6 dpf), o seu desempenho não é tão favorável para estádios mais precoces (como os 2 dpf). Deste modo, alternativas que possam ser usadas para todos os estádios de desenvolvimento são necessárias. Aqui explorámos vários tipos de marcadores de contraste: mScarlet (uma proteína fluorescente associada ao promotor da α-tubulina, na linha transgénica: alphatubulin:mScarlet), DiD (um corante lipídico que marca membranas celulares) e BODIPY TR methyl ester (um corante que marca membranas de organelos celulares). Em relação às marcações de contraste alternativas à marcação por tERK (anticorpo), alphatubulin:mScarlet parece ser uma potencial alternativa, uma vez que permite a marcação desde estágios precoces de desenvolvimento até estágios mais avançados e também permite não só a imagiologia de tecido fixo como também permite a imagiologia in vivo. DiD, também apresenta algumas vantagens em relação ao tERK, podendo ser tido como alternativa a este. O BODIPY TR, pelo contrário, não parece ser uma alternativa adequada. Em termos de posicionamento durante a montagem dos embriões para imagiologia, experimentaram-se duas orientações diferentes: horizontal (convencional) e vertical (alternativa). Isto, porque o cérebro dos embriões de peixe-zebra apresenta uma curvatura que faz com que haja estruturas que fiquem menos acessíveis à imagiologia. Ambas as posições permitiram a imagiologia de grande parte do cérebro, podendo ser alternadas dependendo das estruturas que se pretende estudar. Ainda em relação à imagiologia dos cérebros de estádios precoces de desenvolvimento, usou-se a microscopia confocal e de light sheet. A microscopia confocal apresenta uma resolução elevada que permite o estudo detalhado das estruturas cerebrais, enquanto que a microscopia de light sheet permite a rotação da amostra dentro do microscópio permitindo a imagiologia a partir de vários ângulos, para uma mesma amostra. Em suma, através da caracterização anatómica e da exploração de alternativas para estádios de desenvolvimento precoces, tencionou-se contribuir em parte para o enriquecimento das bases de dados já existentes com a caracterização de duas novas linhas transgénicas e em parte para a melhoria da imagiologia do cérebro precoce dos embriões de peixe-zebra. Isto, tendo em conta o objetivo geral do laboratório (Orger Lab) de construir atlas anatómicos digitais para os vários estádios de desenvolvimento e para cada linha transgénica.
Autores principais:	Viegas, Mariana Bray
Assunto:	Desenvolvimento Circuitos neuronais Caracterização anatómica Peixe-zebra Teses de mestrado - 2020
Ano:	2020
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O peixe-zebra (Danio rerio) é um peixe de água doce da família dos ciprinídeos. Em neurociência, o uso do peixe-zebra como modelo tem vindo a aumentar, pois este apresenta um padrão anatómico e circuitos neuronais semelhantes à maioria dos vertebrados. Para além disso, a sua transparência natural em estados lavares permite a imagiologia do cérebro in vivo. Devido à sua corrente popularidade, existem várias ferramentas genéticas disponíveis que permitem a criação de linhas transgénicas estáveis. No peixe-zebra, o desenvolvimento do cérebro ocorre num curto período de tempo. A neurogénese inicia-se por volta das 10 horas após fertilização (hpf), ainda durante a gastrulação. Nesta etapa forma-se um modelo primário da rede neuronal. A axogénese destes neurónios inicia-se entre as 14 e 24 hpf. A neurogénese secundária, expande a rede neuronal primária, não existindo separação temporal clara entre as duas fases. Durante o 1º dpf o tubo neural é formado e sofre morfogénese regional criando 10 neurómeros entre o prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo. Esta regionalização (rostro-caudal e dorso-ventral) contribui para o desenvolvimento dos vários subtipos de neurónios e células gliais uma vez que fornece gradientes de fatores parácrinos e sinais celulares. Assim, no final do 1º dpf, os embriões já apresentam contrações musculares espontâneas, ao 2º dia de desenvolvimento os embriões respondem ao toque e no final da primeira semana de desenvolvimento, as larvas exibem um conjunto de comportamentos inatos, entre os quais os comportamentos visualmente-guiados. Os comportamentos visualmente-guiados são comportamentos exibidos naturalmente pelas larvas do peixe-zebra e podem ser controlados em laboratório. A resposta optocinética é um movimento reflexivo do olho que permite que o organismo siga um estímulo rotativo. A resposta optomotora é uma adaptação do comportamento natatório a uma mudança percecionada no movimento da água. Para compreender como o cérebro controla estes comportamentos é importante identificar os circuitos que estão por detrás destes e isto é possível com a criação de linhas transgénicas. As linhas transgénicas aqui referidas foram geradas pelo Orger Lab (Fundação Champalimaud – Centre for the Unknown) através da introdução por transgénese mediada por transposão de um fragmento genético de peixe-zebra. O fragmento genético introduzido contém um gene de interesse, que se sabe previamente que tem expressão em certas populações neuronais. Associado ao primeiro codão deste gene de interesse está o GFF (derivado de Gal4). Por cruzamento destas linhas transgénicas com uma linha UAS:GFP, é possível exprimir o repórter (GFP – Green Fluorescent Protein) nas populações neuronais onde o gene de interesse é naturalmente expresso. Após imagiologia, é necessário atribuir a cada estrutura uma região cerebral num processo chamado de caracterização anatómica. Neste momento, vários atlas digitais e bases de dados do cérebro do peixe-zebra têm sido desenvolvidos para o estádio de 6 dpf, como o Z-Brain, Zebrafish Brain Browser e o Mas-Planck Zebrafish Brain Atlas. No entanto, para estádios mais precoces de desenvolvimento, apenas tentativas parciais foram realizadas. Desta forma, os objetivos desta dissertação são: caracterizar anatomicamente duas linhas transgénicas (Tg(Pitx2c:GFF) e TgBAC(sst1:GFF) geradas pelo Orger Lab) e explorar marcações de contraste e posições de montagem adequadas para o estudo dos estágios de desenvolvimento precoces em peixe-zebra. As imagens da caracterização anatómica foram adquiridas através de microscopia confocal após um tratamento imunohistoquímico e de seguida submetidas a análise de imagem e caracterização anatómica. Por comparação visual com bibliografia, atlas e bases de dados previamente descritos, a caracterização anatómica foi efetuada, identificando estruturas cerebrais no prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo. Na caracterização anatómica, ambas as linhas mostraram expressão de GFP desde o 1º dpf até ao 6º dpf. Nos primeiros dias de desenvolvimento a expressão é, no geral, mais fraca, sendo que a sua distribuição espacial e nível de expressão aumentam com o passar do tempo. O padrão de expressão de GFP parece ser estabelecido em torno do 3º e 4º dpf. Após estes estágios, o padrão espacial mantém-se verificando-se apenas o crescimento em número de células até aos 6 dpf. O gene Pitx2c codifica um fator de transcrição. A linha Tg(Pitx2c:GFF) tem expressão de GFP em regiões cujo gene – Pitx2c – já tinha mostrado expressão prévia. Entre as quais, destaca-se a assimetria encontrada no diencéfalo (mais propriamente no epitálamo), a expressão no núcleo do fascículo longitudinal medial (nMLF), no núcleo oculomotor e na retina. Todas estas estruturas anatómicas estão envolvidas nos circuitos que formam os comportamentos de resposta optocinética e optomotora. O gene sst1 codifica o neurotransmissor de somatostatina. A linha TgBAC(sst1:GFF) também apresenta expressão em estruturas previamente descritas com expressão do gene, como o cerebelo. Outras regiões, como epitálamo, pálio, sub-pálio e núcleo interpeduncular também foram aqui verificadas. Estas estruturas, encontram-se associadas às redes neuronais que levam aos comportamentos visualmente-guiados. Devido ao facto dos atlas e bases de dados do cérebro do peixe-zebra se focarem sobretudo em estádios de desenvolvimento mais avançados, não existe ainda um protocolo otimizado para a imagiologia destas amostras quer em termos de marcação de contraste, quer em termos de montagem entre lâmina e lamela. Aqui, tentou-se explorar algumas alternativas a estes casos. O tERK é um anticorpo usado por vários atlas digitais como marcação de contraste. Contudo, e apesar de ser uma boa marcação para estádios mais avançados de desenvolvimento (como os 6 dpf), o seu desempenho não é tão favorável para estádios mais precoces (como os 2 dpf). Deste modo, alternativas que possam ser usadas para todos os estádios de desenvolvimento são necessárias. Aqui explorámos vários tipos de marcadores de contraste: mScarlet (uma proteína fluorescente associada ao promotor da α-tubulina, na linha transgénica: alphatubulin:mScarlet), DiD (um corante lipídico que marca membranas celulares) e BODIPY TR methyl ester (um corante que marca membranas de organelos celulares). Em relação às marcações de contraste alternativas à marcação por tERK (anticorpo), alphatubulin:mScarlet parece ser uma potencial alternativa, uma vez que permite a marcação desde estágios precoces de desenvolvimento até estágios mais avançados e também permite não só a imagiologia de tecido fixo como também permite a imagiologia in vivo. DiD, também apresenta algumas vantagens em relação ao tERK, podendo ser tido como alternativa a este. O BODIPY TR, pelo contrário, não parece ser uma alternativa adequada. Em termos de posicionamento durante a montagem dos embriões para imagiologia, experimentaram-se duas orientações diferentes: horizontal (convencional) e vertical (alternativa). Isto, porque o cérebro dos embriões de peixe-zebra apresenta uma curvatura que faz com que haja estruturas que fiquem menos acessíveis à imagiologia. Ambas as posições permitiram a imagiologia de grande parte do cérebro, podendo ser alternadas dependendo das estruturas que se pretende estudar. Ainda em relação à imagiologia dos cérebros de estádios precoces de desenvolvimento, usou-se a microscopia confocal e de light sheet. A microscopia confocal apresenta uma resolução elevada que permite o estudo detalhado das estruturas cerebrais, enquanto que a microscopia de light sheet permite a rotação da amostra dentro do microscópio permitindo a imagiologia a partir de vários ângulos, para uma mesma amostra. Em suma, através da caracterização anatómica e da exploração de alternativas para estádios de desenvolvimento precoces, tencionou-se contribuir em parte para o enriquecimento das bases de dados já existentes com a caracterização de duas novas linhas transgénicas e em parte para a melhoria da imagiologia do cérebro precoce dos embriões de peixe-zebra. Isto, tendo em conta o objetivo geral do laboratório (Orger Lab) de construir atlas anatómicos digitais para os vários estádios de desenvolvimento e para cada linha transgénica.