Publicação

Genotypic analysis of the Leishmania infantum resistance to conventional drugs and new chemically synthesized compounds

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A leishmaniose, doença parasitária com manifestações clínicas diversas, é considerada uma das mais importantes patologias parasitárias. É causada por cerca de 20 espécies de protozoários intracelulares do género Leishmania sendo, na maioria dos casos, uma zoonose de mamíferos selvagens ou domésticos que atinge acidentalmente o Homem. Este parasita é transmitido aos hospedeiros vertebrados pela picada de flebotomídeos do género Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo. O ciclo de vida deste inclui dois estadios com duas formas morfológicas distintas: forma amastigota no interior dos macrófagos do hospedeiro vertebrado e forma promastigota no intestino do insecto vector. Com base nas suas manifestações clínicas a leishmaniose pode ser classificada em três tipos principais: leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose visceral. Leishmania infantum é o agente responsável pela leishmaniose visceral zoonótica, manifestação severa e mortal da doença, que se distribui pela região da bacia do Mediterrâneo incluindo Portugal. Há mais de 70 anos que os antimoniais pentavalentes (SbV), como estibogluconato de sódio (STB) e antimoniato de meglumina (MGA), têm sido usados como tratamento de primeira linha em todas as manifestações clínicas da doença. Estes fármacos, apesar de serem bastante eficazes no combate à leishmaniose, apresentam toxicidade elevada, sendo responsáveis por efeitos secundários graves. Nos últimos anos, a sensibilidade do parasita a estes fármacos tem sofrido alterações problemáticas em algumas regiões endémicas para Leishmania. Novos fármacos mais eficazes e/ou menos tóxicos têm vindo a ser usados em resposta à diferenciação de estirpes do parasita com menor sensibilidade aos antimoniais ou em situações clinicas de maior gravidade. Porém, o elevado custo torna impossível a utilização regular destes fármacos nos países mais afectados, uma vez que esta doença está frequentemente associada a países de baixa renda. Apesar da elevada quantidade de fármacos anti-Leishmania actualmente em uso, nenhum deles conjuga elevada eficiência, baixa toxicidade e custo acessível às populações afectadas. No seu conjunto, estes factores fazem da investigação de novos fármacos anti-Leishmania uma prioridade. Actualmente a investigação de novos fármacos está muito focada em compostos existentes com actividade terapêutica dirigida a outras doenças, compostos de origem natural ou formulações de herbicidas. Entre estes últimos compostos encontram-se os derivados de dinitroanilinas, nomeadamente a orizalina (ORZ) e compostos análogos da trifluralina (TFL), tendo o seu potencial no tratamento de leishmaniose sido demonstrado. A diminuição da sensibilidade do parasita aos fármacos em uso foi relacionada com a habilidade de amplificar selectivamente o número de cópias de alguns genes em resposta ao contacto com as formulações. A amplificação génica é considerada o principal mecanismo de resistência a fármacos dentro do género Leishmania. O pequeno genoma e a reduzida quantidade de genes fazem deste parasita um alvo ideal para o estudo deste fenómeno. A ausência de controlo da transcrição é também um dos factores de sucesso da amplificação génica como mecanismo adaptativo, tendo sido demonstrado que o DNA amplificado pode atingir 10% do DNA total do parasita. Alterações na permeabilidade da membrana, permitindo uma inferior acumulação do fármaco dentro da célula, redução na importação do fármaco, inactivação do fármaco ou sequestro em compartimentos intracelulares são os mecanismos usados por Leishmania para sobreviver ao contacto com fármacos anti-Leishmania. O aumento do número de cópias dos genes das proteínas responsáveis por estes mecanismos está directamente relacionado com o aumento do respectivo nível de expressão mas também com o aumento da probabilidade de ocorrência de mutações pontuais em algumas destas cópias que poderão vir a ser vantajosas para a sobrevivência do parasita quando em contacto com fármacos. Neste estudo foi avaliado o potencial anti-Leishmania em modelo animal de um fármaco anti-Leishmania clássico, o estibogluconato de sódio, da dinitoanilina orizalina e de novos compostos sintéticos análogos da trifluralina, TFL-A3 e TFL-A6, que demonstraram elevada actividade anti-Leishmania e baixa toxicidade in vitro. Em modelo animal o tratamento não conduz à eliminação completa dos parasitas, tendo-se colocado em hipótese que os parasitas sobreviventes serão menos sensíveis ou resistentes aos fármacos usados. Neste estudo os parasitas que sobreviveram ao tratamento foram quantificados e recolhidos para extracção de DNA e o número de cópias de genes seleccionados foi quantificado por PCR em tempo real. Estudos anteriores efectuados em amostras recolhidas de pacientes de áreas endémicas de leishmaniose demonstraram que a menor susceptibilidade do parasita aos fármacos está relacionada com a amplificação dos seguintes genes: os genes para os transportadores de membrana MRPA (MRPA) e MDR1 (MDR1), o gene para a enzima gama-glutamil-cisteína sintetase (GSH1), envolvida na síntese de glutationa e tripanotiona, e o gene para a enzima pteridina redutase (PTR1), que intervém na cascata metabólica do folato. A quantificação absoluta do número de cópias de cada gene por parasita foi possível recorrendo a um gene de cópia única no genoma de Leishmania, o gene para a subunidade catalítica alfa da DNA polimerase. Foi também analisada a amplificação génica dos quatro genes seleccionados na forma promastigota do parasita (in vitro). Promastigotas de L. infantum foram tornados resistentes a antimoniato de meglumina, miltefosina, TFL-A3 e TFL-A6, e o número de genes quantificado por PCR em tempo real. Foi demonstrado que a actividade anti-Leishmania dos compostos TFL-A6 e orizalina é bastante promissora, sendo muito semelhante à actividade do estibogluconato de sódio. TFL-A3 apresentou actividade anti-Leishmaniamais reduzida. Os parasitas que in vivo sobreviveram ao tratamento com estibogluconato de sódio apresentaram aumento significativo do número de cópias dos genes MDR1 e PTR1, sugerindo amplificação da capacidade de expulsão deste fármaco do interior do parasita e alterações na via metabólica do folato, reduzindo a quantidade de intermediários de espécies reactivas de oxigénio e azoto. Apesar de existirem duvidas devido ao facto das amostras serem provenientes de doentes que poderiam ter estado sujeitos a fármacos adicionais, a amplificação de MDR1 tinha sido demonstrada em estudos anteriores. O presente estudo vem mostrar que a amplificação de MDR1 ocorre de facto em parasitas que estiveram unicamente em contacto com estibogluconato de sódio. Os parasitas provenientes de murganhos tratados com TFL-A3 apenas apresentaram aumento do número de cópias do gene MDR1. Os parasitas isolados a partir do grupo tratado com TFL-A6 apresentaram amplificação dos genes MDR1, MRPA e PTR1. Esta amplificação indica que o mecanismo de resistência está associado ao efluxo do fármaco pelo parasita, ao sequestro do fármaco para compartimentos intracelulares do parasita e a alterações na quantidade de espécies reactivas de oxigénio e azoto que se formam. Nos parasitas que estiveram em contacto com a orizalina os genes GSH1, MDR1 e PTR1 apresentam aumento do número de cópias. No caso da orizalina o mecanismo usado parece estar relacionado com o aumento de efluxo do composto, alterações na quantidade de espécies reactivas de oxigénio e azoto e alterações no balanço do potencial reductor no interior do parasita. Nas experiências in vitro os promastigotas resistentes a antimoniato de meglumina, miltefosina, TFL-A3 ou TFL-A6 demonstraram resultados distintos dos encontrados nos parasitas resultantes dos murganhos que foram sujeitos a tratamento. Estas diferenças podem ser explicadas pelo modo como diferentes formas morfológicas do parasita reagem quando contactam com o fármaco. Nas experiências in vivo a forma amastigota encontrava-se internalizada pelos macrófagos do hospedeiro, retida no interior dos fagolisossomas, enquanto nas experiências in vitro a forma promastigota encontrava-se livre no meio de cultura. Os diferentes ambientes (amastigota – intracelular, rodeado por duas membranas, pH ácido, 37ºC, sujeito a acções do sistema imunitário do hospedeiro; promastigota – livre, meio de cultura, pH neutro, 24ºC) induzem a diferenciação pelo parasita de diferentes mecanismos de adaptação e sobrevivência. Os promastigotas resistentes a antimoniato de meglumina demonstraram um aumento significativo do número de cópias de GSH1 e redução do número de cópias de MDR1. Os parasitas resistentes a miltefosina não apresentaram qualquer alteração significativa no número dos genes estudados. Os parasitas resistentes a TFL-A3 apresentaram amplificação do gene GSH1 e os resistentes a TFL-A6 demonstraram um aumento significativo do número dos genes GSH1, MDR1 e PTR1. Com este estudo é possível concluir que uma elevada actividade anti-Leishmania e uma baixa toxicidade pode não ser suficiente para um composto ser considerado uma boa alternativa aos fármacos actualmente usados. Resistência a TFL-A6 parece dever-se a indução de mecanismos semelhantes aos responsáveis pela resistência aos fármacos actualmente em uso. O desenvolvimento de menor sensibilidade ou resistência pode conduzir à rápida diminuição da eficiência anti-Leishmania deste composto ou mesmo à ineficácia no combate a estirpes já resistentes aos fármacos em uso. Todos estes factores devem ser tidos em consideração no desenvolvimento de novos compostos anti-Leishmania, prevenindo o aparecimento de estirpes menos susceptíveis mas também como forma de minimizar o investimento em fármacos que à partida não deveriam ser considerados como alternativa para tratamento da leishmaniose.
Autores principais:	Mateus, David Jorge Santos, 1986-
Assunto:	Leishmania infantum Fármacos Teses de mestrado - 2014
Ano:	2014
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A leishmaniose, doença parasitária com manifestações clínicas diversas, é considerada uma das mais importantes patologias parasitárias. É causada por cerca de 20 espécies de protozoários intracelulares do género Leishmania sendo, na maioria dos casos, uma zoonose de mamíferos selvagens ou domésticos que atinge acidentalmente o Homem. Este parasita é transmitido aos hospedeiros vertebrados pela picada de flebotomídeos do género Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo. O ciclo de vida deste inclui dois estadios com duas formas morfológicas distintas: forma amastigota no interior dos macrófagos do hospedeiro vertebrado e forma promastigota no intestino do insecto vector. Com base nas suas manifestações clínicas a leishmaniose pode ser classificada em três tipos principais: leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose visceral. Leishmania infantum é o agente responsável pela leishmaniose visceral zoonótica, manifestação severa e mortal da doença, que se distribui pela região da bacia do Mediterrâneo incluindo Portugal. Há mais de 70 anos que os antimoniais pentavalentes (SbV), como estibogluconato de sódio (STB) e antimoniato de meglumina (MGA), têm sido usados como tratamento de primeira linha em todas as manifestações clínicas da doença. Estes fármacos, apesar de serem bastante eficazes no combate à leishmaniose, apresentam toxicidade elevada, sendo responsáveis por efeitos secundários graves. Nos últimos anos, a sensibilidade do parasita a estes fármacos tem sofrido alterações problemáticas em algumas regiões endémicas para Leishmania. Novos fármacos mais eficazes e/ou menos tóxicos têm vindo a ser usados em resposta à diferenciação de estirpes do parasita com menor sensibilidade aos antimoniais ou em situações clinicas de maior gravidade. Porém, o elevado custo torna impossível a utilização regular destes fármacos nos países mais afectados, uma vez que esta doença está frequentemente associada a países de baixa renda. Apesar da elevada quantidade de fármacos anti-Leishmania actualmente em uso, nenhum deles conjuga elevada eficiência, baixa toxicidade e custo acessível às populações afectadas. No seu conjunto, estes factores fazem da investigação de novos fármacos anti-Leishmania uma prioridade. Actualmente a investigação de novos fármacos está muito focada em compostos existentes com actividade terapêutica dirigida a outras doenças, compostos de origem natural ou formulações de herbicidas. Entre estes últimos compostos encontram-se os derivados de dinitroanilinas, nomeadamente a orizalina (ORZ) e compostos análogos da trifluralina (TFL), tendo o seu potencial no tratamento de leishmaniose sido demonstrado. A diminuição da sensibilidade do parasita aos fármacos em uso foi relacionada com a habilidade de amplificar selectivamente o número de cópias de alguns genes em resposta ao contacto com as formulações. A amplificação génica é considerada o principal mecanismo de resistência a fármacos dentro do género Leishmania. O pequeno genoma e a reduzida quantidade de genes fazem deste parasita um alvo ideal para o estudo deste fenómeno. A ausência de controlo da transcrição é também um dos factores de sucesso da amplificação génica como mecanismo adaptativo, tendo sido demonstrado que o DNA amplificado pode atingir 10% do DNA total do parasita. Alterações na permeabilidade da membrana, permitindo uma inferior acumulação do fármaco dentro da célula, redução na importação do fármaco, inactivação do fármaco ou sequestro em compartimentos intracelulares são os mecanismos usados por Leishmania para sobreviver ao contacto com fármacos anti-Leishmania. O aumento do número de cópias dos genes das proteínas responsáveis por estes mecanismos está directamente relacionado com o aumento do respectivo nível de expressão mas também com o aumento da probabilidade de ocorrência de mutações pontuais em algumas destas cópias que poderão vir a ser vantajosas para a sobrevivência do parasita quando em contacto com fármacos. Neste estudo foi avaliado o potencial anti-Leishmania em modelo animal de um fármaco anti-Leishmania clássico, o estibogluconato de sódio, da dinitoanilina orizalina e de novos compostos sintéticos análogos da trifluralina, TFL-A3 e TFL-A6, que demonstraram elevada actividade anti-Leishmania e baixa toxicidade in vitro. Em modelo animal o tratamento não conduz à eliminação completa dos parasitas, tendo-se colocado em hipótese que os parasitas sobreviventes serão menos sensíveis ou resistentes aos fármacos usados. Neste estudo os parasitas que sobreviveram ao tratamento foram quantificados e recolhidos para extracção de DNA e o número de cópias de genes seleccionados foi quantificado por PCR em tempo real. Estudos anteriores efectuados em amostras recolhidas de pacientes de áreas endémicas de leishmaniose demonstraram que a menor susceptibilidade do parasita aos fármacos está relacionada com a amplificação dos seguintes genes: os genes para os transportadores de membrana MRPA (MRPA) e MDR1 (MDR1), o gene para a enzima gama-glutamil-cisteína sintetase (GSH1), envolvida na síntese de glutationa e tripanotiona, e o gene para a enzima pteridina redutase (PTR1), que intervém na cascata metabólica do folato. A quantificação absoluta do número de cópias de cada gene por parasita foi possível recorrendo a um gene de cópia única no genoma de Leishmania, o gene para a subunidade catalítica alfa da DNA polimerase. Foi também analisada a amplificação génica dos quatro genes seleccionados na forma promastigota do parasita (in vitro). Promastigotas de L. infantum foram tornados resistentes a antimoniato de meglumina, miltefosina, TFL-A3 e TFL-A6, e o número de genes quantificado por PCR em tempo real. Foi demonstrado que a actividade anti-Leishmania dos compostos TFL-A6 e orizalina é bastante promissora, sendo muito semelhante à actividade do estibogluconato de sódio. TFL-A3 apresentou actividade anti-Leishmaniamais reduzida. Os parasitas que in vivo sobreviveram ao tratamento com estibogluconato de sódio apresentaram aumento significativo do número de cópias dos genes MDR1 e PTR1, sugerindo amplificação da capacidade de expulsão deste fármaco do interior do parasita e alterações na via metabólica do folato, reduzindo a quantidade de intermediários de espécies reactivas de oxigénio e azoto. Apesar de existirem duvidas devido ao facto das amostras serem provenientes de doentes que poderiam ter estado sujeitos a fármacos adicionais, a amplificação de MDR1 tinha sido demonstrada em estudos anteriores. O presente estudo vem mostrar que a amplificação de MDR1 ocorre de facto em parasitas que estiveram unicamente em contacto com estibogluconato de sódio. Os parasitas provenientes de murganhos tratados com TFL-A3 apenas apresentaram aumento do número de cópias do gene MDR1. Os parasitas isolados a partir do grupo tratado com TFL-A6 apresentaram amplificação dos genes MDR1, MRPA e PTR1. Esta amplificação indica que o mecanismo de resistência está associado ao efluxo do fármaco pelo parasita, ao sequestro do fármaco para compartimentos intracelulares do parasita e a alterações na quantidade de espécies reactivas de oxigénio e azoto que se formam. Nos parasitas que estiveram em contacto com a orizalina os genes GSH1, MDR1 e PTR1 apresentam aumento do número de cópias. No caso da orizalina o mecanismo usado parece estar relacionado com o aumento de efluxo do composto, alterações na quantidade de espécies reactivas de oxigénio e azoto e alterações no balanço do potencial reductor no interior do parasita. Nas experiências in vitro os promastigotas resistentes a antimoniato de meglumina, miltefosina, TFL-A3 ou TFL-A6 demonstraram resultados distintos dos encontrados nos parasitas resultantes dos murganhos que foram sujeitos a tratamento. Estas diferenças podem ser explicadas pelo modo como diferentes formas morfológicas do parasita reagem quando contactam com o fármaco. Nas experiências in vivo a forma amastigota encontrava-se internalizada pelos macrófagos do hospedeiro, retida no interior dos fagolisossomas, enquanto nas experiências in vitro a forma promastigota encontrava-se livre no meio de cultura. Os diferentes ambientes (amastigota – intracelular, rodeado por duas membranas, pH ácido, 37ºC, sujeito a acções do sistema imunitário do hospedeiro; promastigota – livre, meio de cultura, pH neutro, 24ºC) induzem a diferenciação pelo parasita de diferentes mecanismos de adaptação e sobrevivência. Os promastigotas resistentes a antimoniato de meglumina demonstraram um aumento significativo do número de cópias de GSH1 e redução do número de cópias de MDR1. Os parasitas resistentes a miltefosina não apresentaram qualquer alteração significativa no número dos genes estudados. Os parasitas resistentes a TFL-A3 apresentaram amplificação do gene GSH1 e os resistentes a TFL-A6 demonstraram um aumento significativo do número dos genes GSH1, MDR1 e PTR1. Com este estudo é possível concluir que uma elevada actividade anti-Leishmania e uma baixa toxicidade pode não ser suficiente para um composto ser considerado uma boa alternativa aos fármacos actualmente usados. Resistência a TFL-A6 parece dever-se a indução de mecanismos semelhantes aos responsáveis pela resistência aos fármacos actualmente em uso. O desenvolvimento de menor sensibilidade ou resistência pode conduzir à rápida diminuição da eficiência anti-Leishmania deste composto ou mesmo à ineficácia no combate a estirpes já resistentes aos fármacos em uso. Todos estes factores devem ser tidos em consideração no desenvolvimento de novos compostos anti-Leishmania, prevenindo o aparecimento de estirpes menos susceptíveis mas também como forma de minimizar o investimento em fármacos que à partida não deveriam ser considerados como alternativa para tratamento da leishmaniose.