Publicação

Functional and dynamic studies on bacterial two-component signal transduction systems with focus on sensor histidine kinases and their sensor domains

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A comunicação microbiana é um processo essencial que regula vários mecanismos fisiológicos importantes, como a virulência, a formação de biofilmes e a resistência a antibióticos. Essa capacidade de coordenação entre microrganismos exerce um impacto profundo na sua adaptação ao ambiente, tornandose, por isso, um tema central de estudo na microbiologia. Nesse contexto, os sistemas de dois componentes (TCS) desempenham um papel central. Estes, permitem que as bactérias tenham capacidade de resposta a uma ampla gama de estímulos ambientais, como variações de temperatura, pressão osmótica, pH, e presença de compostos antimicrobianos. Os TCS, como o próprio nome indica, são formados por dois componentes: a cinase de histidina (HK) e o regulador de resposta (RR). A HK, localizada geralmente na membrana celular, recebe o estímulo ambiental e autofosforila numa histidina, que é conservada. Posteriormente, o grupo fosforil é transferido para um aspartato no RR, ativando-o e permitindo que regule a expressão de genes específicos (Papon & Stock, 2019; Stock et al., 2000). Apesar de sua importância para a adaptação e sobrevivência bacteriana, os detalhes estruturais e funcionais desses sistemas ainda não foram totalmente elucidados, limitando a compreensão de como a especificidade e a regulação desses mecanismos são influenciadas por diferentes sinais ambientais. Embora técnicas como cristalografia de raios-X, ligações cruzadas com cisteína, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) e simulações de dinâmica molecular tenham fornecido modelos iniciais sobre as interações entre a HK e o RR, o conhecimento completo dos mecanismos regulatórios ainda está por alcançar. Isso resulta numa compreensão limitada da fisiologia bacteriana, particularmente no que diz respeito a processos como a regulação de genes envolvidos na resistência a antibióticos ou na formação de biofilmes. O sistema de dois-componentes, SpaK (HK) e SpaR (RR) é importante para a deteção e regulação do lantibiótico subtilina, produzido por Bacillus subtilis. No entanto, os detalhes estruturais da interação entre a SpaK e a subtilina continuam a ser pouco compreendidos, em parte devido à ausência de dados estruturais tanto da SpaK isolada como do complexo SpaK-subtilina. O foco desta tese é a interação entre a cinase de histidina SpaK e o regulador de resposta SpaR, desencadeada pela ligação do domíno sensor (SD) SpaK com a subtilina. A subtilina é um lantibiótico – uma classe de antibióticos peptídicos produzidos por bactérias que desempenha um papel crucial na comunicação interbacteriana e na regulação de funções essenciais, como a resistência a antibióticos. O objetivo principal deste trabalho foi identificar resíduos críticos envolvidos na interação com a subtilina através da medição da atividade da proteína SpaK selvagem (WT). Um modelo da SpaK gerado pelo AlphaFold2 guiou simulações de dinâmica, permitindo identificar resíduos de aminoácidos importantes na ligação à subtilina. Posteriormente, foi realizada a técnica de alanine scanning com os aminoácidos identificados como importantes para a interação proteina-péptido, na qual os resíduos do SD da SpaK foram sistematicamente substituídos por alanina. Essa abordagem permitiu avaliar quais resíduos são fundamentais para a ligação com a subtilina e determinar se as alterações na atividade de β-galactosidase observadas resultam de uma interrupção na ligação ou de outros fatores, como o enovelamento incorreto da proteína. Para gerar mutantes de SpaK, foi utilizada a técnica de mutagénese sítio-dirigida. Estes mutantes foram analisados usando ensaios de β-galactosidase. O ensaio de β-galactosidase é uma ferramenta bem estabelecida para medir a atividade de interações proteína-substrato em células bacterianas. Ao medir a atividade enzimática da β-galactosidase, é possível correlacionar a presença ou ausência de ligação com mudanças na atividade do sistema SpaK e SpaR, o que, por sua vez, permite identificar resíduos chave envolvidos no reconhecimento da subtilina. Os mutantes foram analisados usando ensaios de β-galactosidase, que revelaram que resíduos específicos, como E53 e L102, são importantes para a ligação à subtilina. A mutação L102A, por exemplo, reduziu significativamente a atividade de β-galactosidase induzida pela subtilina, destacando a importância deste resíduo no reconhecimento do substrato. Em contraste, a mutação E53A tornou a SpaK não funcional, sublinhando o papel crucial deste resíduo na atividade da proteína. E53 pode formar uma ponte salina com R54, estabilizando a interação entre os monómeros, mas a mutação E53A interrompe essa função, resultando na perda de atividade com subtilina. A distância excessiva entre E53 e R54 no modelo AF2 sugere que a flexibilidade do dímero de SpaK permite aproximações necessárias para a interação. Um paralelo é traçado com a cinase de histidina PhoQ, que utiliza interações polares semelhantes para estabilizar sua estrutura, apesar da falta de conservação de sequência entre SpaK e PhoQ. O resíduo hidrofóbico L102 também é crucial para o funcionamento de SpaK. A mutação de L102 para alanina enfraquece a interação com subtilina, interferindo na transdução do sinal. Devido à diversidade estrutural das cinases de histidina, mais ensaios são necessários para conhecer o papel exato de L102. Para entender melhor as funções de E53 e L102 e suas interações com subtilina, são sugeridas técnicas avançadas, como cristalografia de raios-X. A análise da resposta à dose mostrou que, embora algumas mutações aumentassem a afinidade de ligação da subtilina, elas comprometiam a atividade máxima de β-galactosidase, sugerindo um equilíbrio entre afinidade de ligação e a função biológica do sistema, como o que se observa em outros sistemas de dois components como PhoQP. Além disso, foi testado um substrato não nativo, o lantibiótico nisina A, que não ativou o sistema SpaK-SpaR, confirmando a especificidade da SpaK pela subtilina. Outro foco deste estudo, além dos estudos funcionais, foi o estabelecimento de um protocolo de purificação da SpaK, visando possibilitar investigações estruturais mais detalhadas desta proteína. Como o foco principal está no domínio sensor, que não é solúvel, a proteína SpaK foi purificada juntamente com os domínios sensor e transmembranar (Spak SD + TM). A purificação de proteínas é uma etapa fundamental para a análise das suas propriedades bioquímicas e funcionais, especialmente no caso de proteínas integrais de membrana, como a SpaK, que apresentam desafios técnicos adicionais devido à sua localização e função na membrana celular. Foram realizados testes com diferentes detergentes, incluindo DDM, LMNG e DM, para otimizar a solubilização da SpaK. A escolha de detergentes adequados foi fundamental para manter a conformação nativa da proteína enquanto se tentou cristalizá-la, um passo importante para obter uma visão detalhada da sua estrutura tridimensional. Detergentes como LDAO e OG também foram considerados para otimizar as condições de cristalização. Os ensaios preliminares de cristalografia de raios-X com detergentes DDM e DM mostraram resultados promissores. A próxima etapa será tentar co-cristalizar a SpaK juntamente com a subtilina, o que poderia revelar detalhes cruciais sobre o mecanismo de interação entre essas moléculas e melhorar o conhecimento sobre a sinalização bacteriana. Estudos estruturais subsequentes focaram na otimização do processo de solubilização e purificação do complexo SpaK SD + TM. Foram testados vários detergentes, como DDM, LMNG e DM, que apresentaram resultados promissores na purificação da proteína. LDAO e OG foram sugeridos para otimização adicional. A co-cristalização do complexo SpaK com a subtilina poderia fornecer uma visão detalhada da sua estrutura e mecanismos de interação, contribuindo para uma melhor compreensão da sinalização bacteriana. Compreender o comportamento microbiano e os mecanismos de sinalização é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e biotecnológicas. Além disso, tal compreensão pode ter um impacto significativo em problemas globais, como a resistência a antimicrobianos e a sustentabilidade agrícola. Ao melhorar o nosso conhecimento sobre a comunicação microbiana, esta pesquisa visa avanços nas aplicações médicas e ambientais, incluindo o controlo de patógenos e inovações na biotecnologia.
Autores principais:	Todoriko, Iryna
Assunto:	Comunicação microbiana Sistemas de dois componentes Cinase de histidina Ligação de substrato e lantibióticos Teses de mestrado - 2025
Ano:	2025
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A comunicação microbiana é um processo essencial que regula vários mecanismos fisiológicos importantes, como a virulência, a formação de biofilmes e a resistência a antibióticos. Essa capacidade de coordenação entre microrganismos exerce um impacto profundo na sua adaptação ao ambiente, tornandose, por isso, um tema central de estudo na microbiologia. Nesse contexto, os sistemas de dois componentes (TCS) desempenham um papel central. Estes, permitem que as bactérias tenham capacidade de resposta a uma ampla gama de estímulos ambientais, como variações de temperatura, pressão osmótica, pH, e presença de compostos antimicrobianos. Os TCS, como o próprio nome indica, são formados por dois componentes: a cinase de histidina (HK) e o regulador de resposta (RR). A HK, localizada geralmente na membrana celular, recebe o estímulo ambiental e autofosforila numa histidina, que é conservada. Posteriormente, o grupo fosforil é transferido para um aspartato no RR, ativando-o e permitindo que regule a expressão de genes específicos (Papon & Stock, 2019; Stock et al., 2000). Apesar de sua importância para a adaptação e sobrevivência bacteriana, os detalhes estruturais e funcionais desses sistemas ainda não foram totalmente elucidados, limitando a compreensão de como a especificidade e a regulação desses mecanismos são influenciadas por diferentes sinais ambientais. Embora técnicas como cristalografia de raios-X, ligações cruzadas com cisteína, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) e simulações de dinâmica molecular tenham fornecido modelos iniciais sobre as interações entre a HK e o RR, o conhecimento completo dos mecanismos regulatórios ainda está por alcançar. Isso resulta numa compreensão limitada da fisiologia bacteriana, particularmente no que diz respeito a processos como a regulação de genes envolvidos na resistência a antibióticos ou na formação de biofilmes. O sistema de dois-componentes, SpaK (HK) e SpaR (RR) é importante para a deteção e regulação do lantibiótico subtilina, produzido por Bacillus subtilis. No entanto, os detalhes estruturais da interação entre a SpaK e a subtilina continuam a ser pouco compreendidos, em parte devido à ausência de dados estruturais tanto da SpaK isolada como do complexo SpaK-subtilina. O foco desta tese é a interação entre a cinase de histidina SpaK e o regulador de resposta SpaR, desencadeada pela ligação do domíno sensor (SD) SpaK com a subtilina. A subtilina é um lantibiótico – uma classe de antibióticos peptídicos produzidos por bactérias que desempenha um papel crucial na comunicação interbacteriana e na regulação de funções essenciais, como a resistência a antibióticos. O objetivo principal deste trabalho foi identificar resíduos críticos envolvidos na interação com a subtilina através da medição da atividade da proteína SpaK selvagem (WT). Um modelo da SpaK gerado pelo AlphaFold2 guiou simulações de dinâmica, permitindo identificar resíduos de aminoácidos importantes na ligação à subtilina. Posteriormente, foi realizada a técnica de alanine scanning com os aminoácidos identificados como importantes para a interação proteina-péptido, na qual os resíduos do SD da SpaK foram sistematicamente substituídos por alanina. Essa abordagem permitiu avaliar quais resíduos são fundamentais para a ligação com a subtilina e determinar se as alterações na atividade de β-galactosidase observadas resultam de uma interrupção na ligação ou de outros fatores, como o enovelamento incorreto da proteína. Para gerar mutantes de SpaK, foi utilizada a técnica de mutagénese sítio-dirigida. Estes mutantes foram analisados usando ensaios de β-galactosidase. O ensaio de β-galactosidase é uma ferramenta bem estabelecida para medir a atividade de interações proteína-substrato em células bacterianas. Ao medir a atividade enzimática da β-galactosidase, é possível correlacionar a presença ou ausência de ligação com mudanças na atividade do sistema SpaK e SpaR, o que, por sua vez, permite identificar resíduos chave envolvidos no reconhecimento da subtilina. Os mutantes foram analisados usando ensaios de β-galactosidase, que revelaram que resíduos específicos, como E53 e L102, são importantes para a ligação à subtilina. A mutação L102A, por exemplo, reduziu significativamente a atividade de β-galactosidase induzida pela subtilina, destacando a importância deste resíduo no reconhecimento do substrato. Em contraste, a mutação E53A tornou a SpaK não funcional, sublinhando o papel crucial deste resíduo na atividade da proteína. E53 pode formar uma ponte salina com R54, estabilizando a interação entre os monómeros, mas a mutação E53A interrompe essa função, resultando na perda de atividade com subtilina. A distância excessiva entre E53 e R54 no modelo AF2 sugere que a flexibilidade do dímero de SpaK permite aproximações necessárias para a interação. Um paralelo é traçado com a cinase de histidina PhoQ, que utiliza interações polares semelhantes para estabilizar sua estrutura, apesar da falta de conservação de sequência entre SpaK e PhoQ. O resíduo hidrofóbico L102 também é crucial para o funcionamento de SpaK. A mutação de L102 para alanina enfraquece a interação com subtilina, interferindo na transdução do sinal. Devido à diversidade estrutural das cinases de histidina, mais ensaios são necessários para conhecer o papel exato de L102. Para entender melhor as funções de E53 e L102 e suas interações com subtilina, são sugeridas técnicas avançadas, como cristalografia de raios-X. A análise da resposta à dose mostrou que, embora algumas mutações aumentassem a afinidade de ligação da subtilina, elas comprometiam a atividade máxima de β-galactosidase, sugerindo um equilíbrio entre afinidade de ligação e a função biológica do sistema, como o que se observa em outros sistemas de dois components como PhoQP. Além disso, foi testado um substrato não nativo, o lantibiótico nisina A, que não ativou o sistema SpaK-SpaR, confirmando a especificidade da SpaK pela subtilina. Outro foco deste estudo, além dos estudos funcionais, foi o estabelecimento de um protocolo de purificação da SpaK, visando possibilitar investigações estruturais mais detalhadas desta proteína. Como o foco principal está no domínio sensor, que não é solúvel, a proteína SpaK foi purificada juntamente com os domínios sensor e transmembranar (Spak SD + TM). A purificação de proteínas é uma etapa fundamental para a análise das suas propriedades bioquímicas e funcionais, especialmente no caso de proteínas integrais de membrana, como a SpaK, que apresentam desafios técnicos adicionais devido à sua localização e função na membrana celular. Foram realizados testes com diferentes detergentes, incluindo DDM, LMNG e DM, para otimizar a solubilização da SpaK. A escolha de detergentes adequados foi fundamental para manter a conformação nativa da proteína enquanto se tentou cristalizá-la, um passo importante para obter uma visão detalhada da sua estrutura tridimensional. Detergentes como LDAO e OG também foram considerados para otimizar as condições de cristalização. Os ensaios preliminares de cristalografia de raios-X com detergentes DDM e DM mostraram resultados promissores. A próxima etapa será tentar co-cristalizar a SpaK juntamente com a subtilina, o que poderia revelar detalhes cruciais sobre o mecanismo de interação entre essas moléculas e melhorar o conhecimento sobre a sinalização bacteriana. Estudos estruturais subsequentes focaram na otimização do processo de solubilização e purificação do complexo SpaK SD + TM. Foram testados vários detergentes, como DDM, LMNG e DM, que apresentaram resultados promissores na purificação da proteína. LDAO e OG foram sugeridos para otimização adicional. A co-cristalização do complexo SpaK com a subtilina poderia fornecer uma visão detalhada da sua estrutura e mecanismos de interação, contribuindo para uma melhor compreensão da sinalização bacteriana. Compreender o comportamento microbiano e os mecanismos de sinalização é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e biotecnológicas. Além disso, tal compreensão pode ter um impacto significativo em problemas globais, como a resistência a antimicrobianos e a sustentabilidade agrícola. Ao melhorar o nosso conhecimento sobre a comunicação microbiana, esta pesquisa visa avanços nas aplicações médicas e ambientais, incluindo o controlo de patógenos e inovações na biotecnologia.