Publicação

Optimization of a single-oocyte subcellular transcriptomic approach to study Drosophila oocyte patterning

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Introdução: A Drosophila melanogaster é amplamente utilizada em diversas áreas de investigação por ser um organismo pequeno, com ciclo de vida curto, muita descendência, de fácil manutenção dispondo de diversas ferramentas genéticas bem estabelecidas. Em particular, o desenvolvimento do oócito de Drosophila constitui um sistema clássico de estudo da gametogénese feminina. Atualmente, a evolução da tecnologia permite revisitar conceitos base com novas perspectivas. A mosca do vinagre fêmea tem dois grandes ovários interligados por um oviduto. Cada ovário é composto por vários ovaríolos, que são fileiras de câmaras ovarianas (egg chambers) em diferentes estádios de desenvolvimento. Enquanto na extremidade posterior do ovaríolo encontramos o ovo maduro, na ponta oposta do ovaríolo encontramos o germário, que contém células estaminais que se dividem para formar quistos de 16 células. Dessas células, apenas uma se diferencia em oócito, enquanto as 15 células restantes se diferenciam em células nutritivas (nurse cells) que suportam o desenvolvimento do oócito, fornecendo nutrientes e RNAs maternos através dos ring canals. Cada egg chamber é constituída por essas 16 células circundadas por uma única camada de células foliculares somáticas, que contribuem para formar a membrana vitelina e, posteriormente, o córion. A polaridade celular é uma característica importante para o desenvolvimento do oócito e é definida por uma assimetria estrutural e funcional da célula. No caso do oócito de Drosophila, a quebra da simetria inicial e o estabelecimento da polaridade dependem do transporte de mRNAs maternos das nurse cells para o oócito e sua subsequente localização assimétrica no oócito. A regulação da localização do mRNA dentro do oócito é crucial para a padronização embrionária. Os eixos embrionários de Drosophila são determinados pela localização de mRNAs específicos do oócito, como oskar (osk), bicoid (bcd), nanos (nos) e gurken (grk). Durante a oogénese e o desenvolvimento embrionário inicial, diferentes proteínas formam gradientes a partir de diferentes regiões do oócito e/ou embrião onde os mRNAs são traduzidos. A assimetria na localização de proteínas pode ser alcançada por mecanismos distintos, incluindo a eficiente localização subcelular de mRNAs seguida de tradução local, ou, se os mRNAs são pouco localizados, pela repressão traducional eficiente de mRNAs não localizados, o que restringe a tradução a um pequeno subconjunto de mRNAs localizados em regiões estritas do oócito. A localização subcelular de mRNAs depende de sequências “zipcode", tipicamente localizadas nas regiões 3' ou 5'UTR desses transcritos. Essas sequências são reconhecidas por proteínas específicas de ligação ao RNA que medeiam a interação com complexos de proteínas motoras para o transporte citoplasmático direto. Além disso, a proteção local da degradação do mRNA e/ou movimentos "aleatórios" do mRNA, que são ligeiramente enviesadas para determinada região do oócito, em conjunto com mecanismos de ancoragem, também garantem o enriquecimento do mRNA em regiões subcelulares específicas. Ainda assim, quando os mecanismos de transporte de RNA são ineficientes, a localização assimétrica de proteínas depende da regulação local da tradução. Por exemplo, ao contrário do mRNA bcd, que é eficientemente localizado no pólo anterior do oócito e cuja tradução resulta num gradiente anterior da proteína Bcd, os mRNAs osk e nos são apenas ligeiramente localizados no pólo posterior, exigindo repressão traducional eficiente de mRNAs não localizados para garantir um gradiente posterior destas duas proteínas. O enriquecimento de Osk no pólo posterior é necessário e suficiente para a tradução local de mRNAs do plasma germinal (pole plasm), o que é crítico não só para a padronização posterior, mas também para a segregação das células germinais (pole cells). A tradução local dos mRNAs de nos é assegurada pela repressão, dependente de Bcd, da tradução anterior, enquanto a regulação traducional dos mRNAs grk e osk envolve o complexo eIF4E-Cup-Bru. Durante a oogénese inicial, o mRNA grk está localizado no pólo posterior do oócito em desenvolvimento, contribuindo para a determinação do eixo antero-posterior, conferindo identidade posterior às células foliculares somáticas. Subsequentemente, e à medida que o núcleo do oócito migra para a região anterior, a localização perinuclear do mRNA grk e a sua tradução local, forma um gradiente dorsal cuja função é crítica para a identidade dorsal das células foliculares e para padronização dorsoventral do embrião. Questão biológica e objetivos: A nossa questão biológica é como os mRNAs se localizam dentro de uma célula, mais especificamente, dentro do oócito de Drosophila. Durante décadas, a localização geral do mRNA tem sido estudada principalmente recorrendo a hibridações in situ não-quantitativas. Embora essa abordagem tenha levado a importantes contributos para o nosso conhecimento científico, esta pode, no entanto, levar a interpretações incorretas. Por exemplo, hibridações in situ para bcd revelam um enriquecimento cortical anterior e hibridações in situ para de osk e nos revelam um enriquecimento cortical posterior no oócito. No entanto, abordagens por northern blot mostraram claramente que, enquanto o mRNA bcd é eficientemente localizado na região anterior do oócito, a maioria dos mRNAs nos e osk não está localizada posteriormente sendo que apenas uma pequena fração destes é enriquecida na região posterior. Para ultrapassar estas limitações, recentemente têm sido desenvolvidas novas metodologias de hibridação in situ com fluorescência quantitativa. No entanto, estas metodologias, embora excelentes na descrição da localização e cinética de mRNAs únicos dentro da célula, não fornecem uma perspectiva genome-wide do transcriptoma subcelular durante o desenvolvimento. Este projeto visa desenvolver uma nova abordagem de transcriptómica subcelular capaz de fazer uma análise genome-wide, quantitativa e imparcial da localização de mRNA. O nosso objetivo é usar esta metodologia para estudar a dinâmica subcelular do oócito de Drosophila em desenvolvimento. Abordagem Experimental: Utilizámos um conjunto de equipamento experimental desenvolvido pelo laboratório de Ivo Telley que permite uma colheita precisa de citoplasma de regiões distintas (anterior e posterior) de oócitos de Drosophila nos estádios 10 e 12. O oócito de D. melanogaster é um sistema ideal para este estudo, uma vez que é passível de micromanipulação, live-cell imaging e da adoção de diversas abordagens genéticas. A montagem experimental de micromanipulação é constituída por dois (ou mais) suportes de micropipetas que são controlados por controladores de precisão de coordenadas x, y, z e uma bomba de seringas de dois sentidos que é conectada a um dos suportes de micropipetas por um tubo de teflon. As micropipetas são produzidas no nosso laboratório, a partir de capilares de borossilicato estirado de modo a obter pontas com comprimento e largura ideais, evitando o dano das extremidades frequentemente observado em micropipetas pré-fabricadas. Resultados: A nossa abordagem de transcriptómica subcelular suporta estudos prévios mostrando que, apesar de bcd apresentar assimetrias significativas na localização subcelular de mRNAs, a abundancia dos mRNAs osk e nos não apresentam diferenças significativas entre as regiões anterior e posterior do oócito. Adicionalmente, esta análise transcriptómica detetou vários genes maternais localizados e mostrou que a região dorso-anterior do oócito possui um conjunto único de mRNAs localizados. Identificámos centenas de mRNAs localizados assimetricamente ao longo do eixo antero-posterior que, aparentemente, não apresentam enriquecimento cortical no oócito, o que explica o facto destes serem tipicamente classificados como mRNAs maternais não localizados por estudos prévios baseados em hibridação in situ não-quantitativa. Em conjunto, e pese embora a necessidade de mais estudos nesta temática, estes resultados sugerem fortemente que a nossa abordagem de transcriptómica subcelular é viável e pode fornecer dados confiáveis e reprodutíveis para estudar a localização de mRNA e a sua dinâmica. Conclusão: Este trabalho validou o uso de uma abordagem de transcriptómica subcelular para estudar a localização de RNAs e distinguiu uma nova classe potencial de mRNAs localizados, não identificada por trabalhos prévios de hibridação in situ não-quantitativa, e cuja localização provavelmente será importante para a gametogénese feminina de Drosophila.
Autores principais:	Faria, Maria Leonor Ferraz de Andrade Xavier de
Assunto:	Localização de RNA Oócito de Drosophila Padronização embrionária Transcriptómica subcelular Micromanipulação Teses de mestrado - 2023
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Introdução: A Drosophila melanogaster é amplamente utilizada em diversas áreas de investigação por ser um organismo pequeno, com ciclo de vida curto, muita descendência, de fácil manutenção dispondo de diversas ferramentas genéticas bem estabelecidas. Em particular, o desenvolvimento do oócito de Drosophila constitui um sistema clássico de estudo da gametogénese feminina. Atualmente, a evolução da tecnologia permite revisitar conceitos base com novas perspectivas. A mosca do vinagre fêmea tem dois grandes ovários interligados por um oviduto. Cada ovário é composto por vários ovaríolos, que são fileiras de câmaras ovarianas (egg chambers) em diferentes estádios de desenvolvimento. Enquanto na extremidade posterior do ovaríolo encontramos o ovo maduro, na ponta oposta do ovaríolo encontramos o germário, que contém células estaminais que se dividem para formar quistos de 16 células. Dessas células, apenas uma se diferencia em oócito, enquanto as 15 células restantes se diferenciam em células nutritivas (nurse cells) que suportam o desenvolvimento do oócito, fornecendo nutrientes e RNAs maternos através dos ring canals. Cada egg chamber é constituída por essas 16 células circundadas por uma única camada de células foliculares somáticas, que contribuem para formar a membrana vitelina e, posteriormente, o córion. A polaridade celular é uma característica importante para o desenvolvimento do oócito e é definida por uma assimetria estrutural e funcional da célula. No caso do oócito de Drosophila, a quebra da simetria inicial e o estabelecimento da polaridade dependem do transporte de mRNAs maternos das nurse cells para o oócito e sua subsequente localização assimétrica no oócito. A regulação da localização do mRNA dentro do oócito é crucial para a padronização embrionária. Os eixos embrionários de Drosophila são determinados pela localização de mRNAs específicos do oócito, como oskar (osk), bicoid (bcd), nanos (nos) e gurken (grk). Durante a oogénese e o desenvolvimento embrionário inicial, diferentes proteínas formam gradientes a partir de diferentes regiões do oócito e/ou embrião onde os mRNAs são traduzidos. A assimetria na localização de proteínas pode ser alcançada por mecanismos distintos, incluindo a eficiente localização subcelular de mRNAs seguida de tradução local, ou, se os mRNAs são pouco localizados, pela repressão traducional eficiente de mRNAs não localizados, o que restringe a tradução a um pequeno subconjunto de mRNAs localizados em regiões estritas do oócito. A localização subcelular de mRNAs depende de sequências “zipcode", tipicamente localizadas nas regiões 3' ou 5'UTR desses transcritos. Essas sequências são reconhecidas por proteínas específicas de ligação ao RNA que medeiam a interação com complexos de proteínas motoras para o transporte citoplasmático direto. Além disso, a proteção local da degradação do mRNA e/ou movimentos "aleatórios" do mRNA, que são ligeiramente enviesadas para determinada região do oócito, em conjunto com mecanismos de ancoragem, também garantem o enriquecimento do mRNA em regiões subcelulares específicas. Ainda assim, quando os mecanismos de transporte de RNA são ineficientes, a localização assimétrica de proteínas depende da regulação local da tradução. Por exemplo, ao contrário do mRNA bcd, que é eficientemente localizado no pólo anterior do oócito e cuja tradução resulta num gradiente anterior da proteína Bcd, os mRNAs osk e nos são apenas ligeiramente localizados no pólo posterior, exigindo repressão traducional eficiente de mRNAs não localizados para garantir um gradiente posterior destas duas proteínas. O enriquecimento de Osk no pólo posterior é necessário e suficiente para a tradução local de mRNAs do plasma germinal (pole plasm), o que é crítico não só para a padronização posterior, mas também para a segregação das células germinais (pole cells). A tradução local dos mRNAs de nos é assegurada pela repressão, dependente de Bcd, da tradução anterior, enquanto a regulação traducional dos mRNAs grk e osk envolve o complexo eIF4E-Cup-Bru. Durante a oogénese inicial, o mRNA grk está localizado no pólo posterior do oócito em desenvolvimento, contribuindo para a determinação do eixo antero-posterior, conferindo identidade posterior às células foliculares somáticas. Subsequentemente, e à medida que o núcleo do oócito migra para a região anterior, a localização perinuclear do mRNA grk e a sua tradução local, forma um gradiente dorsal cuja função é crítica para a identidade dorsal das células foliculares e para padronização dorsoventral do embrião. Questão biológica e objetivos: A nossa questão biológica é como os mRNAs se localizam dentro de uma célula, mais especificamente, dentro do oócito de Drosophila. Durante décadas, a localização geral do mRNA tem sido estudada principalmente recorrendo a hibridações in situ não-quantitativas. Embora essa abordagem tenha levado a importantes contributos para o nosso conhecimento científico, esta pode, no entanto, levar a interpretações incorretas. Por exemplo, hibridações in situ para bcd revelam um enriquecimento cortical anterior e hibridações in situ para de osk e nos revelam um enriquecimento cortical posterior no oócito. No entanto, abordagens por northern blot mostraram claramente que, enquanto o mRNA bcd é eficientemente localizado na região anterior do oócito, a maioria dos mRNAs nos e osk não está localizada posteriormente sendo que apenas uma pequena fração destes é enriquecida na região posterior. Para ultrapassar estas limitações, recentemente têm sido desenvolvidas novas metodologias de hibridação in situ com fluorescência quantitativa. No entanto, estas metodologias, embora excelentes na descrição da localização e cinética de mRNAs únicos dentro da célula, não fornecem uma perspectiva genome-wide do transcriptoma subcelular durante o desenvolvimento. Este projeto visa desenvolver uma nova abordagem de transcriptómica subcelular capaz de fazer uma análise genome-wide, quantitativa e imparcial da localização de mRNA. O nosso objetivo é usar esta metodologia para estudar a dinâmica subcelular do oócito de Drosophila em desenvolvimento. Abordagem Experimental: Utilizámos um conjunto de equipamento experimental desenvolvido pelo laboratório de Ivo Telley que permite uma colheita precisa de citoplasma de regiões distintas (anterior e posterior) de oócitos de Drosophila nos estádios 10 e 12. O oócito de D. melanogaster é um sistema ideal para este estudo, uma vez que é passível de micromanipulação, live-cell imaging e da adoção de diversas abordagens genéticas. A montagem experimental de micromanipulação é constituída por dois (ou mais) suportes de micropipetas que são controlados por controladores de precisão de coordenadas x, y, z e uma bomba de seringas de dois sentidos que é conectada a um dos suportes de micropipetas por um tubo de teflon. As micropipetas são produzidas no nosso laboratório, a partir de capilares de borossilicato estirado de modo a obter pontas com comprimento e largura ideais, evitando o dano das extremidades frequentemente observado em micropipetas pré-fabricadas. Resultados: A nossa abordagem de transcriptómica subcelular suporta estudos prévios mostrando que, apesar de bcd apresentar assimetrias significativas na localização subcelular de mRNAs, a abundancia dos mRNAs osk e nos não apresentam diferenças significativas entre as regiões anterior e posterior do oócito. Adicionalmente, esta análise transcriptómica detetou vários genes maternais localizados e mostrou que a região dorso-anterior do oócito possui um conjunto único de mRNAs localizados. Identificámos centenas de mRNAs localizados assimetricamente ao longo do eixo antero-posterior que, aparentemente, não apresentam enriquecimento cortical no oócito, o que explica o facto destes serem tipicamente classificados como mRNAs maternais não localizados por estudos prévios baseados em hibridação in situ não-quantitativa. Em conjunto, e pese embora a necessidade de mais estudos nesta temática, estes resultados sugerem fortemente que a nossa abordagem de transcriptómica subcelular é viável e pode fornecer dados confiáveis e reprodutíveis para estudar a localização de mRNA e a sua dinâmica. Conclusão: Este trabalho validou o uso de uma abordagem de transcriptómica subcelular para estudar a localização de RNAs e distinguiu uma nova classe potencial de mRNAs localizados, não identificada por trabalhos prévios de hibridação in situ não-quantitativa, e cuja localização provavelmente será importante para a gametogénese feminina de Drosophila.