Publicação

Hit optimization to improve aqueous solubility of compounds with antimycobacterial activity

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A tuberculose (TB) é uma doença infeciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e é considerada uma das 10 principais causas de morte a nível mundial e a principal devida a um único agente. Em 2018 foram reportados 10 milhões de novos casos e 1,5 milhões de mortes. É considerada um perigo para a saúde pública devido ao contínuo aparecimento de novos casos, bem como ao crescimento da resistência antimicrobiana associada aos fármacos atualmente disponíveis. Em pacientes infetados com HIV (Vírus da Imunodeficiência Adquirida), a TB representa a principal causa de morte, sendo a probabilidade de desenvolverem a doença 19 vezes superior quando comparados com pacientes não infetados com HIV. A Organização Mundial da Saúde estima que cerca de 23% da população (1,7 mil milhões de pessoas) tem TB latente. Esta forma da patologia observa-se quando o sistema imunitário é capaz de controlar a propagação do Mtb. Contudo, não apresenta sintomas, o que torna difícil a sua deteção e, caso o sistema imunitário do hospedeiro seja comprometido, pode levar a uma reativação causando, consequentemente, TB ativa. Portanto, pessoas com TB latente representam uma fonte de contaminação e propagação da doença. Fatores como a ausência de uma vacina totalmente eficaz, a longa duração dos tratamentos e o lento desenvolvimento de novos medicamentos, torna difícil a erradicação da TB. O mecanismo de infeção começa com a inalação dos bacilos que, dada a sua reduzida dimensão, conseguem chegar aos alvéolos pulmonares. Seguidamente são fagocitados por macrófagos que têm a capacidade de recrutar outras células imunológicas para o local da infeção. Este recrutamento levará à formação de uma estrutura que impedirá a propagação dos bacilos, denominada granuloma. Esta é tão favorável para o bacilo quanto para o hospedeiro, uma vez que, se por um lado o granuloma impede que o Mtb se espalhe (causando lesões nos pulmões e outros órgãos), por outro lado, o Mtb dentro do granuloma consegue sobreviver, apesar de se encontrar num estado não-replicativo. Na maioria dos casos, o granuloma é suficiente para conter o bacilo, contudo, aquando de um enfraquecimento do sistema imunitário do hospedeiro, o Mtb pode ser libertado e levar ao desenvolvimento de TB ativa. O precoce diagnóstico e correto tratamento são as principais ferramentas para o controlo da doença. A deteção da TB latente pode ser feita in vivo, através do teste da tuberculina complementado com Raios-X ao tórax e análise da expetoração, ou in vitro, pelo ensaio de libertação de interferon-gama. De maneira a providenciar a terapia mais adequada, é realizado um teste de suscetibilidade aos fármacos, possibilitando a deteção de resistências. As várias resistências contra os fármacos atualmente disponíveis constituem um grande perigo na luta contra a TB. Atualmente, estão descritos quatro tipos de resistência, TB resistente à rifampicina; TB multi-resistente, quando resistente pelo menos à isoniazida e rifampicina; TB extensivamente-resistente, em casos onde se observa resistência a todos os fármacos de primeira linha, bem como a pelo menos uma fluoroquinolona e um injetável; e, por fim, TB totalmente-resistente, descrita como resistente a todos os fármacos de primeira e segunda linha. A resistência pode ser transmitida ou adquirida, sendo a primeira o resultado da transmissão direta de estirpes resistentes no momento da infeção, por parte de uma pessoa infetada com a estirpe resistente; e a segunda, consequência do aparecimento de mutações. Estas mutações são maioritariamente espontâneas e observadas em genes que codificam para as proteínas alvo dos fármacos. O atual tratamento da TB suscetível a fármacos inclui seis meses de tratamento, aplicando nos primeiros 2 meses uma terapia com isoniazida, rifampicina, pirazinamida e etambutol, seguidos de 4 meses com isoniazida e rifampicina. Estes fármacos de primeira geração têm como alvo enzimas essenciais ao funcionamento do bacilo, como por exemplo, enzimas envolvidos na síntese de componentes da membrana celular e na síntese proteica. A bedaquilina e a delamanida, fármacos recentemente aprovados, são usados para o tratamento da TB multi-resistente, sendo ambos ativos contra as formas replicantes e não-replicantes do bacilo e contra estirpes suscetíveis e resistentes aos fármacos. Através de um screening contra o Mtb (estirpe H37Rv) de uma biblioteca de compostos do nosso laboratório foi observado que a classe das azaauronas exibia atividade inibitória promissora. Contudo, estes compostos apresentavam problemas relativamente à solubilidade aquosa. Assim sendo, novos compostos foram sintetizados com o objetivo de melhorar a solubilidade aquosa, tentando manter a atividade antimicrobiana que apresentavam. A via sintética das azaaurones inclui quatro passos: (1) acilação de uma anilina usando cloroacetonitrilo, (2) proteção do grupo amina da anilina com grupos acetilo, carbamoilo e benzoilo, (3) ciclização intramolecular, e (4) condensação aldólica. Neste trabalho realizaram-se várias tentativas de otimização dos rendimentos obtidos no passo da ciclização (passo 3), tendo-se testado diferentes bases (com diferentes forças) e o número de equivalentes dos reagentes. Os melhores resultados foram conseguidos com trietilamina (3 eq, 69%) e K2CO3 (1.2 eq, 56%) para os derivados N-acetilo e N-carbamoilo, respetivamente. Foi possível sintetizar uma pequena biblioteca de novos compostos (4b-d, f), com rendimentos moderados a bons. Estes foram caraterizados por 1H NMR, 13C NMR, COSY, HSQC, HMBC e espectrometria de massa. O grau de pureza foi determinado por HPLC. Como mencionado anteriormente, as azaauronas iniciais não apresentavam bons valores de solubilidade o que representa uma grande desvantagem destes compostos dado que a solubilidade é umas das principais e mais importantes propriedades físico-químicas dos compostos na descoberta e desenvolvimento de fármacos. Compostos com reduzida solubilidade aquosa estão associados a problemas de má absorção, e consequentemente, reduzida biodisponibilidade, podendo também afetar os ensaios biológicos, SAR e atividade farmacológica. Assim sendo, é importante determinar este parâmetro o mais cedo possível, para evitar posteriores complicações em fases avançadas do processo de desenvolvimento do fármaco. Existem dois tipos de solubilidade, a termodinâmica e a cinética, que podem ser determinadas dependendo da informação pretendida. Essencialmente, a solubilidade termodinâmica reflete “Até que ponto o composto dissolve?”, e, inversamente, a solubilidade cinética representa “Até que ponto o composto precipita?”. A solubilidade cinética e a termodinâmica apresentam várias diferenças. Nos métodos de determinação da solubilidade cinética, o ensaio começa com o composto previamente dissolvido num solvente orgânico (normalmente, DMSO), ao contrário do que se verifica nos métodos termodinâmicos, que utilizam o composto no estado sólido. Os métodos cinéticos são normalmente utilizados na fase inicial da descoberta de fármacos, dada a facilidade e rapidez dos mesmos; contrariamente ao que se verifica para os métodos termodinâmicos, aplicados em fases posteriores. Neste trabalho foi desenvolvido um método analítico para determinar a solubilidade cinética. Este método consistiu na adição do composto (pré-dissolvido em DMSO) em tampão fosfato e, depois da incubação e centrifugação, o sobrenadante foi analisado por HPLC. As condições do HPLC foram otimizadas para todos os compostos bem como para o padrão utilizado (ácido salicílico). O valor de solubilidade foi determinado através de uma curva de calibração em DSMO. O objetivo de melhorar a solubilidade foi cumprido, quando comparado com o composto inicial 4a, apesar de ter sido observada uma diminuição da atividade para os compostos sintetizados. Esta redução da atividade pode estar relacionada com o perfil lipofílico da membrana celular do Mtb. Foi analisada a possibilidade de estabelecer uma correlação entre a solubilidade e a atividade, contudo não foi possível dado o reduzido número de compostos. Futuramente, deverá ser alargada a biblioteca de derivados de azaauronas, sintetizando compostos com diferentes grupos introduzidos na posição R2 (Figure 8). Tal deverá permitir estabelecer SAR e, também, uma correlação entre a atividade e a solubilidade aquosa para esta família de compostos.
Autores principais:	Freitas, Elisabete Cristina Silva
Assunto:	Solubility Tuberculosis Azaaurones Drug-resistance Teses de mestrado -2020
Ano:	2020
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A tuberculose (TB) é uma doença infeciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e é considerada uma das 10 principais causas de morte a nível mundial e a principal devida a um único agente. Em 2018 foram reportados 10 milhões de novos casos e 1,5 milhões de mortes. É considerada um perigo para a saúde pública devido ao contínuo aparecimento de novos casos, bem como ao crescimento da resistência antimicrobiana associada aos fármacos atualmente disponíveis. Em pacientes infetados com HIV (Vírus da Imunodeficiência Adquirida), a TB representa a principal causa de morte, sendo a probabilidade de desenvolverem a doença 19 vezes superior quando comparados com pacientes não infetados com HIV. A Organização Mundial da Saúde estima que cerca de 23% da população (1,7 mil milhões de pessoas) tem TB latente. Esta forma da patologia observa-se quando o sistema imunitário é capaz de controlar a propagação do Mtb. Contudo, não apresenta sintomas, o que torna difícil a sua deteção e, caso o sistema imunitário do hospedeiro seja comprometido, pode levar a uma reativação causando, consequentemente, TB ativa. Portanto, pessoas com TB latente representam uma fonte de contaminação e propagação da doença. Fatores como a ausência de uma vacina totalmente eficaz, a longa duração dos tratamentos e o lento desenvolvimento de novos medicamentos, torna difícil a erradicação da TB. O mecanismo de infeção começa com a inalação dos bacilos que, dada a sua reduzida dimensão, conseguem chegar aos alvéolos pulmonares. Seguidamente são fagocitados por macrófagos que têm a capacidade de recrutar outras células imunológicas para o local da infeção. Este recrutamento levará à formação de uma estrutura que impedirá a propagação dos bacilos, denominada granuloma. Esta é tão favorável para o bacilo quanto para o hospedeiro, uma vez que, se por um lado o granuloma impede que o Mtb se espalhe (causando lesões nos pulmões e outros órgãos), por outro lado, o Mtb dentro do granuloma consegue sobreviver, apesar de se encontrar num estado não-replicativo. Na maioria dos casos, o granuloma é suficiente para conter o bacilo, contudo, aquando de um enfraquecimento do sistema imunitário do hospedeiro, o Mtb pode ser libertado e levar ao desenvolvimento de TB ativa. O precoce diagnóstico e correto tratamento são as principais ferramentas para o controlo da doença. A deteção da TB latente pode ser feita in vivo, através do teste da tuberculina complementado com Raios-X ao tórax e análise da expetoração, ou in vitro, pelo ensaio de libertação de interferon-gama. De maneira a providenciar a terapia mais adequada, é realizado um teste de suscetibilidade aos fármacos, possibilitando a deteção de resistências. As várias resistências contra os fármacos atualmente disponíveis constituem um grande perigo na luta contra a TB. Atualmente, estão descritos quatro tipos de resistência, TB resistente à rifampicina; TB multi-resistente, quando resistente pelo menos à isoniazida e rifampicina; TB extensivamente-resistente, em casos onde se observa resistência a todos os fármacos de primeira linha, bem como a pelo menos uma fluoroquinolona e um injetável; e, por fim, TB totalmente-resistente, descrita como resistente a todos os fármacos de primeira e segunda linha. A resistência pode ser transmitida ou adquirida, sendo a primeira o resultado da transmissão direta de estirpes resistentes no momento da infeção, por parte de uma pessoa infetada com a estirpe resistente; e a segunda, consequência do aparecimento de mutações. Estas mutações são maioritariamente espontâneas e observadas em genes que codificam para as proteínas alvo dos fármacos. O atual tratamento da TB suscetível a fármacos inclui seis meses de tratamento, aplicando nos primeiros 2 meses uma terapia com isoniazida, rifampicina, pirazinamida e etambutol, seguidos de 4 meses com isoniazida e rifampicina. Estes fármacos de primeira geração têm como alvo enzimas essenciais ao funcionamento do bacilo, como por exemplo, enzimas envolvidos na síntese de componentes da membrana celular e na síntese proteica. A bedaquilina e a delamanida, fármacos recentemente aprovados, são usados para o tratamento da TB multi-resistente, sendo ambos ativos contra as formas replicantes e não-replicantes do bacilo e contra estirpes suscetíveis e resistentes aos fármacos. Através de um screening contra o Mtb (estirpe H37Rv) de uma biblioteca de compostos do nosso laboratório foi observado que a classe das azaauronas exibia atividade inibitória promissora. Contudo, estes compostos apresentavam problemas relativamente à solubilidade aquosa. Assim sendo, novos compostos foram sintetizados com o objetivo de melhorar a solubilidade aquosa, tentando manter a atividade antimicrobiana que apresentavam. A via sintética das azaaurones inclui quatro passos: (1) acilação de uma anilina usando cloroacetonitrilo, (2) proteção do grupo amina da anilina com grupos acetilo, carbamoilo e benzoilo, (3) ciclização intramolecular, e (4) condensação aldólica. Neste trabalho realizaram-se várias tentativas de otimização dos rendimentos obtidos no passo da ciclização (passo 3), tendo-se testado diferentes bases (com diferentes forças) e o número de equivalentes dos reagentes. Os melhores resultados foram conseguidos com trietilamina (3 eq, 69%) e K2CO3 (1.2 eq, 56%) para os derivados N-acetilo e N-carbamoilo, respetivamente. Foi possível sintetizar uma pequena biblioteca de novos compostos (4b-d, f), com rendimentos moderados a bons. Estes foram caraterizados por 1H NMR, 13C NMR, COSY, HSQC, HMBC e espectrometria de massa. O grau de pureza foi determinado por HPLC. Como mencionado anteriormente, as azaauronas iniciais não apresentavam bons valores de solubilidade o que representa uma grande desvantagem destes compostos dado que a solubilidade é umas das principais e mais importantes propriedades físico-químicas dos compostos na descoberta e desenvolvimento de fármacos. Compostos com reduzida solubilidade aquosa estão associados a problemas de má absorção, e consequentemente, reduzida biodisponibilidade, podendo também afetar os ensaios biológicos, SAR e atividade farmacológica. Assim sendo, é importante determinar este parâmetro o mais cedo possível, para evitar posteriores complicações em fases avançadas do processo de desenvolvimento do fármaco. Existem dois tipos de solubilidade, a termodinâmica e a cinética, que podem ser determinadas dependendo da informação pretendida. Essencialmente, a solubilidade termodinâmica reflete “Até que ponto o composto dissolve?”, e, inversamente, a solubilidade cinética representa “Até que ponto o composto precipita?”. A solubilidade cinética e a termodinâmica apresentam várias diferenças. Nos métodos de determinação da solubilidade cinética, o ensaio começa com o composto previamente dissolvido num solvente orgânico (normalmente, DMSO), ao contrário do que se verifica nos métodos termodinâmicos, que utilizam o composto no estado sólido. Os métodos cinéticos são normalmente utilizados na fase inicial da descoberta de fármacos, dada a facilidade e rapidez dos mesmos; contrariamente ao que se verifica para os métodos termodinâmicos, aplicados em fases posteriores. Neste trabalho foi desenvolvido um método analítico para determinar a solubilidade cinética. Este método consistiu na adição do composto (pré-dissolvido em DMSO) em tampão fosfato e, depois da incubação e centrifugação, o sobrenadante foi analisado por HPLC. As condições do HPLC foram otimizadas para todos os compostos bem como para o padrão utilizado (ácido salicílico). O valor de solubilidade foi determinado através de uma curva de calibração em DSMO. O objetivo de melhorar a solubilidade foi cumprido, quando comparado com o composto inicial 4a, apesar de ter sido observada uma diminuição da atividade para os compostos sintetizados. Esta redução da atividade pode estar relacionada com o perfil lipofílico da membrana celular do Mtb. Foi analisada a possibilidade de estabelecer uma correlação entre a solubilidade e a atividade, contudo não foi possível dado o reduzido número de compostos. Futuramente, deverá ser alargada a biblioteca de derivados de azaauronas, sintetizando compostos com diferentes grupos introduzidos na posição R2 (Figure 8). Tal deverá permitir estabelecer SAR e, também, uma correlação entre a atividade e a solubilidade aquosa para esta família de compostos.