Publicação

Identification of biomarkers in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal e de rápida progressão, caracterizada pela degeneração dos neurónios motores do córtex motor, tronco cerebral e medula espinhal. A maioria dos doentes desenvolve ELA entre os 40 e 70 anos de idade e o diagnóstico baseia-se na observação clínica e testes neurofisiológicos. Os principais sintomas são fraqueza e paralisia progressiva de todos os músculos. Entre 90-95% dos casos de ELA são esporádicos (não têm base genética) e os restantes 5-10% dos casos são familiares e de transmissão autossómica dominante. De entre as mutações características de ELA familiar, cerca de 20% ocorrem no gene que codifica para a enzima Cu/Zn superóxido dismutase 1 (SOD1). Uma vez alterada a actividade enzimática da SOD1, ocorre um aumento dos níveis de anião superóxido, o que contribui para o stresse oxidativo celular. De facto, os eritrócitos de doentes com ELA apresentam mutações na SOD1, às quais acresce desregulação da actividade enzimática do glutatião peroxidase, glutatião reductase e desidrogenase da glucose-6-fosfato. A etiologia da doença é ainda desconhecida mas o stresse oxidativo, disfunções no transporte axonal e nas mitocôndrias, excitotoxicidade induzida por glutamato e neuroinflamação são alguns dos mecanismos apontados para explicar a degeneração dos neurónios motores. Actualmente, falta ainda esclarecer três questões de máxima importância em respeito a esta incapacitante doença: compreender a sua etiologia, identificar biomarcadores moleculares que possam ajudar no diagnóstico e descobrir uma terapêutica efectiva. Os glóbulos vermelhos transportam oxigénio dos pulmões para os tecidos e dióxido carbono destes para os pulmões, contribuindo também para a regulação da viscosidade sanguínea através da captação e libertação de agentes vasoactivos, como o monóxido de azoto (NO), e da modulação das propriedades mecânicas. O NO é uma molécula sinalizadora produzida no sistema nervoso central que modula a actividade neurológica e o fluxo sanguíneo. Uma vez que participa no stresse oxidativo, o NO medeia mecanismos de neuroprotecção e neurotoxicidade. Como factor neurotóxico, promove o stresse oxidativo através da sua reacção com o anião superóxido para formar peroxinitrito e, consequentemente, outros metabolitos reactivos. Estas espécies reactivas de monóxido de azoto (RNOS) podem induzir a quebra de cadeias de DNA, peroxidação lipídica, nitração e nitrosilação de proteínas, disfunção mitocondrial e apoptose, contribuindo para os processos de neuroinflamação, descritos na ELA. Uma vez sintetizado pela enzima endotelial constitutiva, denominada sintase do monóxido de azoto (eNOS), o NO pode difundir para as células musculares lisas adjacentes ou para o lúmen vascular. Uma vez no músculo liso, leva a relaxamento muscular. Quando difundido para o lúmen vascular, o NO é capturado pelos glóbulos vermelhos, que o armazenam e libertam, regulando assim a agregação e deformabilidade eritrocitárias, afectando a capacidade que estas células têm em circular pelos capilares. O influxo de NO para o eritrócito faz-se inicialmente por ligação à proteína de membrana band-3 e depende do grau de fosforilação da mesma. Uma vez dentro do glóbulo vermelho, o NO conjuga-se com a hemoglobina, dependendo do seu grau de desnaturação, e com oxigénio, induzindo a produção de metahemoglobina. É da combinação do NO com as diferentes moléculas e proteínas existentes no eritrócito que resultam o S-nitrosoglutatião (GSNO), nitritos e nitratos, compostos relativamente inertes. O GSNO é produzido pela conjugação do glutatião com o NO dentro do eritrócito e funciona como reservatório, transportador, dador e mediador endógeno de NO, sendo considerado uma molécula antioxidante. Por sua vez, os nitritos e nitratos resultam essencialmente da decomposição dos peroxinitritos, mas também da ligação do NO a oxigénio e hemoglobina. A acetilcolinesterase (AChE) está localizada na membrana externa dos eritrócitos, onde é conhecida como marcador da integridade de membrana dos mesmos, uma vez que ajuda a manter a normal circulação sanguínea e oxigenação dos tecidos. A acetilcolina (ACh) não-neuronal, substracto natural da AChE, poder ser considerada um modulador das propriedades hemoreológicas dos eritrócitos e uma molécula sinalizadora que contribui para a manutenção da homeostasia celular, tendo um papel central na microvasculatura. A ACh existe na circulação sanguínea e actua como efector da vasodilatação, uma vez que estimula a produção de NO pela eNOS, dependendo do grau de integridade da membrana. Desta forma, a ACh também participa na mobilização de NO e seus derivados no eritrócito. Para tal, a ligação da ACh plasmática à AChE da membrana do glóbulo vermelho inicia um mecanismo de transdução de sinal que envolve as proteínas Gi e band-3 de membrana, estimulando o efluxo de NO do eritrócito e a mobilização de nitritos e nitratos. Como mencionado anteriormente, os eritrócitos de doentes com ELA apresentam um excesso de espécies reactivas de oxigénio, o que sugere a implicação das mesmas em funções bioquímicas e hemoreológicas. O objectivo principal deste estudo foi avaliar e comparar os parâmetros hemoreológicos e bioquímicos dos eritrócitos de doentes de ELA com os de dadores saudáveis. Para além disso, o projecto pretendeu identificar um parâmetro que, uma vez aumentado ou diminuído na doença, por comparação à situação fisiológica normal, se pudesse destacar como biomarcador. Para tal, fez-se colheita de amostras sanguíneas de 40 controlos e de 82 doentes de ELA, depois de todos os participantes terem assinado o consentimento informado. Foram feitos testes que estimassem a agregação e deformabilidade eritrocitárias, o efluxo de NO, a actividade enzimática da AChE e as concentrações intraeritrocitárias de nitritos, nitratos e GSNO. Verificou-se que a deformabilidade e actividade da AChE estavam aumentadas nos doentes de ELA por comparação aos controlos. Por outro lado, o efluxo eritrocitário de NO e concentração intraeritrocitária de nitritos foram menores na doença. Não foram observadas diferenças significativas entre o grupo controlo e de doentes quanto à agregação e concentrações intraeritrocitárias de nitratos e GSNO. Porém, considerando exclusivamente os doentes de ELA, foi verificada uma relação entre a concentração de nitritos existente dentro dos eritrócitos e a actividade da AChE, na qual os nitritos, apesar de existirem sempre em baixas concentrações dentro dos glóbulos vermelhos dos doentes, estão aumentados em duas gamas de valores específicos de actividade da AChE. Uma vez que este aumento de nitritos é concordante com o efluxo de NO do eritrócito para os mesmos valores de actividade de AChE, pode ser sugerido um mecanismo compensatório no qual há menos libertação de NO quando os nitritos estão reduzidos no interior do glóbulo vermelho e mais efluxo de NO em valores de AChE para os quais os nitritos existem mais no interior do eritrócito. Foi igualmente demonstrada uma relação entre o efluxo de NO e a Função Respiratória dos participantes, na qual concentrações superiores de NO fora do eritrócito correspondem a uma pior função respiratória. Assim, é legítimo concluir que se o NO fosse mantido no interior do glóbulo vermelho, a Função Respiratória seria mais facilmente assegurada, ou seja, seria benéfico que o eritrócito actuasse como captador e reservatório de NO. Contudo, o estudo mostrou que o NO não é mantido no eritrócito, o que, mais uma vez e considerando o sistema pulmonar, pode ser justificado por um mecanismo compensatório no qual, quando a Função Respiratória está comprometida, o eritrócito liberta mais NO para que este possa ser utilizado pelos tecidos pulmonares. Os resultados do presente estudo indicam que o eritrócito pode contribuir para a biodisponibilidade do NO, apresentando uma deformabilidade favorável num endotélio disfuncional, como o descrito na ELA. Adicionalmente, os resultados sugerem que a AChE do eritrócito possa vir a ser um marcador na ELA. Para tal propõe-se a continuação deste estudo com a introdução de mediadores pró e anti-inflamatórios e a análise da associação com os valores da AChE.
Autores principais:	Lima, Catarina Duarte
Assunto:	Esclerose Lateral Amiotrófica Eritrócito Monóxido de azoto Acetilcolinesterase Nitritos Teses de mestrado - 2015
Ano:	2015
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal e de rápida progressão, caracterizada pela degeneração dos neurónios motores do córtex motor, tronco cerebral e medula espinhal. A maioria dos doentes desenvolve ELA entre os 40 e 70 anos de idade e o diagnóstico baseia-se na observação clínica e testes neurofisiológicos. Os principais sintomas são fraqueza e paralisia progressiva de todos os músculos. Entre 90-95% dos casos de ELA são esporádicos (não têm base genética) e os restantes 5-10% dos casos são familiares e de transmissão autossómica dominante. De entre as mutações características de ELA familiar, cerca de 20% ocorrem no gene que codifica para a enzima Cu/Zn superóxido dismutase 1 (SOD1). Uma vez alterada a actividade enzimática da SOD1, ocorre um aumento dos níveis de anião superóxido, o que contribui para o stresse oxidativo celular. De facto, os eritrócitos de doentes com ELA apresentam mutações na SOD1, às quais acresce desregulação da actividade enzimática do glutatião peroxidase, glutatião reductase e desidrogenase da glucose-6-fosfato. A etiologia da doença é ainda desconhecida mas o stresse oxidativo, disfunções no transporte axonal e nas mitocôndrias, excitotoxicidade induzida por glutamato e neuroinflamação são alguns dos mecanismos apontados para explicar a degeneração dos neurónios motores. Actualmente, falta ainda esclarecer três questões de máxima importância em respeito a esta incapacitante doença: compreender a sua etiologia, identificar biomarcadores moleculares que possam ajudar no diagnóstico e descobrir uma terapêutica efectiva. Os glóbulos vermelhos transportam oxigénio dos pulmões para os tecidos e dióxido carbono destes para os pulmões, contribuindo também para a regulação da viscosidade sanguínea através da captação e libertação de agentes vasoactivos, como o monóxido de azoto (NO), e da modulação das propriedades mecânicas. O NO é uma molécula sinalizadora produzida no sistema nervoso central que modula a actividade neurológica e o fluxo sanguíneo. Uma vez que participa no stresse oxidativo, o NO medeia mecanismos de neuroprotecção e neurotoxicidade. Como factor neurotóxico, promove o stresse oxidativo através da sua reacção com o anião superóxido para formar peroxinitrito e, consequentemente, outros metabolitos reactivos. Estas espécies reactivas de monóxido de azoto (RNOS) podem induzir a quebra de cadeias de DNA, peroxidação lipídica, nitração e nitrosilação de proteínas, disfunção mitocondrial e apoptose, contribuindo para os processos de neuroinflamação, descritos na ELA. Uma vez sintetizado pela enzima endotelial constitutiva, denominada sintase do monóxido de azoto (eNOS), o NO pode difundir para as células musculares lisas adjacentes ou para o lúmen vascular. Uma vez no músculo liso, leva a relaxamento muscular. Quando difundido para o lúmen vascular, o NO é capturado pelos glóbulos vermelhos, que o armazenam e libertam, regulando assim a agregação e deformabilidade eritrocitárias, afectando a capacidade que estas células têm em circular pelos capilares. O influxo de NO para o eritrócito faz-se inicialmente por ligação à proteína de membrana band-3 e depende do grau de fosforilação da mesma. Uma vez dentro do glóbulo vermelho, o NO conjuga-se com a hemoglobina, dependendo do seu grau de desnaturação, e com oxigénio, induzindo a produção de metahemoglobina. É da combinação do NO com as diferentes moléculas e proteínas existentes no eritrócito que resultam o S-nitrosoglutatião (GSNO), nitritos e nitratos, compostos relativamente inertes. O GSNO é produzido pela conjugação do glutatião com o NO dentro do eritrócito e funciona como reservatório, transportador, dador e mediador endógeno de NO, sendo considerado uma molécula antioxidante. Por sua vez, os nitritos e nitratos resultam essencialmente da decomposição dos peroxinitritos, mas também da ligação do NO a oxigénio e hemoglobina. A acetilcolinesterase (AChE) está localizada na membrana externa dos eritrócitos, onde é conhecida como marcador da integridade de membrana dos mesmos, uma vez que ajuda a manter a normal circulação sanguínea e oxigenação dos tecidos. A acetilcolina (ACh) não-neuronal, substracto natural da AChE, poder ser considerada um modulador das propriedades hemoreológicas dos eritrócitos e uma molécula sinalizadora que contribui para a manutenção da homeostasia celular, tendo um papel central na microvasculatura. A ACh existe na circulação sanguínea e actua como efector da vasodilatação, uma vez que estimula a produção de NO pela eNOS, dependendo do grau de integridade da membrana. Desta forma, a ACh também participa na mobilização de NO e seus derivados no eritrócito. Para tal, a ligação da ACh plasmática à AChE da membrana do glóbulo vermelho inicia um mecanismo de transdução de sinal que envolve as proteínas Gi e band-3 de membrana, estimulando o efluxo de NO do eritrócito e a mobilização de nitritos e nitratos. Como mencionado anteriormente, os eritrócitos de doentes com ELA apresentam um excesso de espécies reactivas de oxigénio, o que sugere a implicação das mesmas em funções bioquímicas e hemoreológicas. O objectivo principal deste estudo foi avaliar e comparar os parâmetros hemoreológicos e bioquímicos dos eritrócitos de doentes de ELA com os de dadores saudáveis. Para além disso, o projecto pretendeu identificar um parâmetro que, uma vez aumentado ou diminuído na doença, por comparação à situação fisiológica normal, se pudesse destacar como biomarcador. Para tal, fez-se colheita de amostras sanguíneas de 40 controlos e de 82 doentes de ELA, depois de todos os participantes terem assinado o consentimento informado. Foram feitos testes que estimassem a agregação e deformabilidade eritrocitárias, o efluxo de NO, a actividade enzimática da AChE e as concentrações intraeritrocitárias de nitritos, nitratos e GSNO. Verificou-se que a deformabilidade e actividade da AChE estavam aumentadas nos doentes de ELA por comparação aos controlos. Por outro lado, o efluxo eritrocitário de NO e concentração intraeritrocitária de nitritos foram menores na doença. Não foram observadas diferenças significativas entre o grupo controlo e de doentes quanto à agregação e concentrações intraeritrocitárias de nitratos e GSNO. Porém, considerando exclusivamente os doentes de ELA, foi verificada uma relação entre a concentração de nitritos existente dentro dos eritrócitos e a actividade da AChE, na qual os nitritos, apesar de existirem sempre em baixas concentrações dentro dos glóbulos vermelhos dos doentes, estão aumentados em duas gamas de valores específicos de actividade da AChE. Uma vez que este aumento de nitritos é concordante com o efluxo de NO do eritrócito para os mesmos valores de actividade de AChE, pode ser sugerido um mecanismo compensatório no qual há menos libertação de NO quando os nitritos estão reduzidos no interior do glóbulo vermelho e mais efluxo de NO em valores de AChE para os quais os nitritos existem mais no interior do eritrócito. Foi igualmente demonstrada uma relação entre o efluxo de NO e a Função Respiratória dos participantes, na qual concentrações superiores de NO fora do eritrócito correspondem a uma pior função respiratória. Assim, é legítimo concluir que se o NO fosse mantido no interior do glóbulo vermelho, a Função Respiratória seria mais facilmente assegurada, ou seja, seria benéfico que o eritrócito actuasse como captador e reservatório de NO. Contudo, o estudo mostrou que o NO não é mantido no eritrócito, o que, mais uma vez e considerando o sistema pulmonar, pode ser justificado por um mecanismo compensatório no qual, quando a Função Respiratória está comprometida, o eritrócito liberta mais NO para que este possa ser utilizado pelos tecidos pulmonares. Os resultados do presente estudo indicam que o eritrócito pode contribuir para a biodisponibilidade do NO, apresentando uma deformabilidade favorável num endotélio disfuncional, como o descrito na ELA. Adicionalmente, os resultados sugerem que a AChE do eritrócito possa vir a ser um marcador na ELA. Para tal propõe-se a continuação deste estudo com a introdução de mediadores pró e anti-inflamatórios e a análise da associação com os valores da AChE.