Publicação

The role of MEG3 lncRNA in imprinting and pluripotency

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Desde que se descobriu que as células estaminais embrionárias, descritas como autorrenováveis e pluripotentes, podiam ser obtidas a partir de embriões pré-implantados e expandidas indefinidamente in vitro, muito se especulou sobre as suas possíveis utilizações na medicina regenerativa e na criação de modelos celulares de doenças. Contudo, apesar destas esperanças iniciais, as considerações éticas relativas ao uso de embriões humanos e o risco de imuno-rejeição após transplante inviabilizaram a sua posterior aplicação. A solução para ultrapassar estas limitações parecia ser a criação de células pluripotentes oriundas de células somáticas do próprio paciente, através de um processo de reprogramação celular. Neste sentido, em 2006, foram descritas as primeiras células estaminais pluripotentes induzidas, conhecidas na sigla inglesa por iPSCs, que, por serem semelhantes às células estaminais embrionárias na morfologia e nas capacidades de pluripotência, vieram renovar as expectativas nas suas promissoras aplicações. O processo de reprogramação, no qual é baseado a formação de iPSCs, implica a superação da barreira epigenética das células diferenciadas. Por este motivo, e apesar dos vários avanços na tecnologia da reprogramação, este continua a ser um processo pouco eficiente e propenso a erros epigenéticos, tendo um impacto relevante em fenómenos epigenéticos como é o caso do “genomic imprinting”. O “genomic imprinting” é um processo que ocorre em alguns domínios genómicos e que resulta na expressão génica de apenas um dos alelos parentais. O alelo expresso é determinado com base na diferença de marcas epigenéticas, nomeadamente ao nível da metilação do DNA, entre ambos os alelos. Erros no “imprinting” ocorrem frequentemente durante a reprogramação das iPSCs e têm um impacto negativo na sua capacidade de pluripotência. Contudo, é essencial que o estado de “imprinting” da célula dadora seja preservado ao longo da reprogramação para que a sua utilização futura seja segura. Isto é especialmente importante quando se geram iPSCs derivadas de pacientes com doenças associadas ao “genomic imprinting”, onde é fundamental que o estado de “imprinting” seja mantido, para que estas células possam ser utilizadas na criação de modelos celulares das doenças. Um dos domínios sujeito a “imprinting” descrito como sendo um dos mais suscetíveis a este tipo de erros é o DLK1-DIO3. O domínio DLK1-DIO3 encontra-se localizado no cromossoma 14 humano e no cromossoma 12 murino. Este domínio contém três genes codificantes, DLK1, RTL1 e DIO3, expressos a partir do alelo paterno e vários genes não codificantes expressos a partir do alelo materno, incluindo os RNA não codificantes longos (lncRNA) MEG3, RTL1-antisense (RTL1-AS) e MEG8, assim como RNAs não codificantes pequenos, snoRNAs e microRNAs. O principal elemento envolvido na regulação do “imprinting” é a IG-DMR, que consiste numa região intergénica diferencialmente metilada (DMR) entre os dois alelos, encontrando-se metilada no alelo paterno e desmetilada no alelo materno. Para além da IG-DMR, outras DMRs estão descritas neste domínio, como por exemplo a MEG3-DMR, localizada na zona do promotor do lncRNA MEG3. A desregulação do “imprinting” neste locus causa duas síndromes em humanos, conhecidas como síndrome de Temple (associada à perda de expressão de genes codificantes paternos e sobre-expressão dos RNA não codificantes maternos), e síndrome de Kagami-Ogata (associado à perda de expressão dos genes não codificantes maternos e sobre-expressão dos genes paternos) caracterizados por múltiplos problemas de desenvolvimento físico e intelectual. A desregulação do “imprinting” é também muito frequente em iPSCs, onde o alelo materno tem tendência em adquirir hipermetilação, o que conduz à perda de expressão do lncRNA MEG3 e dos outros RNAs não codificantes. Consequentemente, estas iPSCs têm menores capacidades de pluripotência e diferenciam menos eficientemente em determinados tipos celulares. A contribuição de cada gene desregulado nestas iPSCs, incluindo o silenciamento do lncRNA MEG3, para este fenótipo é desconhecido. Tal como ocorre noutros domínios “imprinted”, acredita-se que também neste seja um dos seus lncRNAs o responsável pela regulação do “imprinting”. O candidato principal é o MEG3 e vários estudos anteriores, onde se realizou “Knockouts” para este gene, apontam para esta possibilidade. Contudo, estas abordagens não permitem garantir que seja efetivamente a molécula de lncRNA do MEG3 a responsável, pois os “Knockouts” causam a eliminação da sequência do DNA do gene MEG3 (incluindo também sequências adjacentes), e, portanto, a atribuição do impacto somente ao lncRNA transcrito por esta região não é correta. Desta forma, o principal objetivo desta dissertação é averiguar o papel deste lncRNA na regulação do ”imprinting” deste domínio e na pluripotência através da modulação dos níveis de expressão deste RNA. Como ponto de partida para o estudo da regulação do “imprinting”, utilizámos iPSCs isogénicas que apresentavam diferentes padrões de metilação no IG-DMR: uma linha iPSC com IG-DMR normal (alelo paterno metilado e alelo materno desmetilado), e outra linha iPSC com IG-DMR hipermetilado (ambos os alelos parentais metilados). Assim, começámos por avaliar o impacto da hipermetilação do IG-DMR no estado de metilação do MEG3-DMR, tal como na expressão do próprio MEG3 e de outros RNAs não codificantes como o lncRNA MEG8. Observámos que a hipermetilação do IG-DMR resultou na hipermetilação do MEG3-DMR, e que nestes casos não havia, como esperado, expressão do lncRNA MEG3, nem do lncRNA MEG8. De seguida, quisemos perceber como estas alterações afetavam o “imprinting” do DLK1, ou seja, se este se tornaria bialélico na linha iPSC com IG-DMR hipermetilado e sem expressão do MEG3. Como esperado, verificou-se que esta linha iPSC apresentava expressão bialélica do DLK1. Contudo, ao contrário da nossa previsão, observámos que a linha iPSC com padrão de metilação normal, exibia também expressão bialélica do DLK1. Enquanto esta investigação decorria, um estudo recentemente publicado sobre células estaminais embrionárias de ratinho permitiu-nos entender este resultado inesperado. Nesse estudo foi descrito que células no estádio estaminal expressavam bialelicamente um nível muito baixo de Dlk1, e que apenas durante a diferenciação neuronal é que os níveis de expressão do Dlk1 aumentavam no alelo paterno, sendo que no alelo materno os níveis se mantinham sempre muito baixos através de um mecanismo de regulação que possivelmente envolve o lncRNA Meg3. Neste sentido, o passo seguinte foi induzir a diferenciação neuronal nas iPSCs para avaliar se ocorria o aumento da expressão do DLK1 e, se na ausência do MEG3, a expressão se tornava bialélica. Observámos que efetivamente, havia um pico de expressão muito significativo no dia 17 da diferenciação e que na linha celular hipermetilada e sem expressão do MEG3, a expressão era claramente bialélica, enquanto que na linha celular com padrão e expressão de MEG3 normais, os resultados indicaram, preferencialmente, uma tendência para a expressão do alelo paterno. Pensamos que esta tendência apenas não foi traduzida numa expressão claramente monoalélica, devido ao facto de dentro do conjunto de células analisadas a maioria ter uma expressão monoalélica do DLK1, enquanto que a minoria restante pudesse ter expressão bialélica devida a uma incorreção do estado de metilação do IG-DMR. A nossa análise na linha iPSC com IG-DMR hipermetilado e sem expressão do MEG3 é coerente com a possibilidade do lncRNA MEG3 ter um papel fulcral na regulação do “imprinting” e, como consequência, na pluripotência das iPSCs. Para entendermos especificamente o papel desempenhado pelo lncRNA MEG3 no “imprinting”, decidimos silenciar a expressão deste lncRNA. Para tal, utilizámos “Antisense Locked Nucleic Acids (LNA) GapmeRs”, que demonstrámos serem uma ferramenta bastante eficiente no silenciamento da expressão do MEG3 em iPSCs indiferenciadas. Verificámos que a par do silenciamento do lncRNA MEG3, também o lncRNA MEG8 foi silenciado, o que contribuí para a ideia de que ambos fazem parte da mesma unidade de transcrição policistrónica. Em seguida, decidimos realizar a experiência do silenciamento do MEG3 no dia 17 da diferenciação neuronal na linha iPSC com preponderância de expressão do DLK1 a partir do alelo paterno. O propósito desta experiência foi entender se o silenciamento do lncRNA MEG3 revertia a expressão maioritariamente paterna em expressão bialélica, onde ambos os alelos parentais se expressassem de forma equitativa. Infelizmente, esta experiência não funcionou por motivos técnicos, muito provavelmente, devido à natureza e densidade celulares durante este estádio de diferenciação. Por essa razão, decidimos então proceder ao silenciamento do MEG3 em fibroblastos, as únicas células estudadas sobre as quais sabíamos que o DLK1 era exclusivamente expresso pelo cromossoma paterno. Nesta experiência, o silenciamento do MEG3 foi muito eficaz (<5% da expressão normal) e levou a uma reativação modesta do alelo materno do DLK1. Este resultado sugere a participação de RNAs não codificantes como o MEG3 ou mesmo o MEG8, também silenciado nesta experiência, na regulação do “imprinting” deste gene. Em suma, com este trabalho foi possível testar pela primeira vez o impacto real do lncRNA MEG3 na regulação do “imprinting” do domínio DLK1-DIO3. Os resultados aqui apresentados, sugerem que o MEG3 e/ou outros RNAs não codificantes expressos no alelo materno, como, por exemplo, o MEG8, podem ter um papel importante na regulação do “imprinting” em todo o domínio. No futuro, será interessante investigar através da abordagem de silenciamento com LNAs GapmeRs contra o MEG3 ou até mesmo contra o MEG8, o impacto noutras linhas celulares com níveis mais abundantes de expressão monoalélica do DLK1. Também será importante estudar os mecanismos de atuação destes e de outros lncRNAs, de modo a garantir a manutenção correta do “imprinting” neste locus.
Autores principais:	Godinho, Inês Filipa Banha
Assunto:	Epigenética Metilação do DNA Genomic Imprinting Pluripotência lncRNA MEG3 Teses de mestrado - 2018
Ano:	2018
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Desde que se descobriu que as células estaminais embrionárias, descritas como autorrenováveis e pluripotentes, podiam ser obtidas a partir de embriões pré-implantados e expandidas indefinidamente in vitro, muito se especulou sobre as suas possíveis utilizações na medicina regenerativa e na criação de modelos celulares de doenças. Contudo, apesar destas esperanças iniciais, as considerações éticas relativas ao uso de embriões humanos e o risco de imuno-rejeição após transplante inviabilizaram a sua posterior aplicação. A solução para ultrapassar estas limitações parecia ser a criação de células pluripotentes oriundas de células somáticas do próprio paciente, através de um processo de reprogramação celular. Neste sentido, em 2006, foram descritas as primeiras células estaminais pluripotentes induzidas, conhecidas na sigla inglesa por iPSCs, que, por serem semelhantes às células estaminais embrionárias na morfologia e nas capacidades de pluripotência, vieram renovar as expectativas nas suas promissoras aplicações. O processo de reprogramação, no qual é baseado a formação de iPSCs, implica a superação da barreira epigenética das células diferenciadas. Por este motivo, e apesar dos vários avanços na tecnologia da reprogramação, este continua a ser um processo pouco eficiente e propenso a erros epigenéticos, tendo um impacto relevante em fenómenos epigenéticos como é o caso do “genomic imprinting”. O “genomic imprinting” é um processo que ocorre em alguns domínios genómicos e que resulta na expressão génica de apenas um dos alelos parentais. O alelo expresso é determinado com base na diferença de marcas epigenéticas, nomeadamente ao nível da metilação do DNA, entre ambos os alelos. Erros no “imprinting” ocorrem frequentemente durante a reprogramação das iPSCs e têm um impacto negativo na sua capacidade de pluripotência. Contudo, é essencial que o estado de “imprinting” da célula dadora seja preservado ao longo da reprogramação para que a sua utilização futura seja segura. Isto é especialmente importante quando se geram iPSCs derivadas de pacientes com doenças associadas ao “genomic imprinting”, onde é fundamental que o estado de “imprinting” seja mantido, para que estas células possam ser utilizadas na criação de modelos celulares das doenças. Um dos domínios sujeito a “imprinting” descrito como sendo um dos mais suscetíveis a este tipo de erros é o DLK1-DIO3. O domínio DLK1-DIO3 encontra-se localizado no cromossoma 14 humano e no cromossoma 12 murino. Este domínio contém três genes codificantes, DLK1, RTL1 e DIO3, expressos a partir do alelo paterno e vários genes não codificantes expressos a partir do alelo materno, incluindo os RNA não codificantes longos (lncRNA) MEG3, RTL1-antisense (RTL1-AS) e MEG8, assim como RNAs não codificantes pequenos, snoRNAs e microRNAs. O principal elemento envolvido na regulação do “imprinting” é a IG-DMR, que consiste numa região intergénica diferencialmente metilada (DMR) entre os dois alelos, encontrando-se metilada no alelo paterno e desmetilada no alelo materno. Para além da IG-DMR, outras DMRs estão descritas neste domínio, como por exemplo a MEG3-DMR, localizada na zona do promotor do lncRNA MEG3. A desregulação do “imprinting” neste locus causa duas síndromes em humanos, conhecidas como síndrome de Temple (associada à perda de expressão de genes codificantes paternos e sobre-expressão dos RNA não codificantes maternos), e síndrome de Kagami-Ogata (associado à perda de expressão dos genes não codificantes maternos e sobre-expressão dos genes paternos) caracterizados por múltiplos problemas de desenvolvimento físico e intelectual. A desregulação do “imprinting” é também muito frequente em iPSCs, onde o alelo materno tem tendência em adquirir hipermetilação, o que conduz à perda de expressão do lncRNA MEG3 e dos outros RNAs não codificantes. Consequentemente, estas iPSCs têm menores capacidades de pluripotência e diferenciam menos eficientemente em determinados tipos celulares. A contribuição de cada gene desregulado nestas iPSCs, incluindo o silenciamento do lncRNA MEG3, para este fenótipo é desconhecido. Tal como ocorre noutros domínios “imprinted”, acredita-se que também neste seja um dos seus lncRNAs o responsável pela regulação do “imprinting”. O candidato principal é o MEG3 e vários estudos anteriores, onde se realizou “Knockouts” para este gene, apontam para esta possibilidade. Contudo, estas abordagens não permitem garantir que seja efetivamente a molécula de lncRNA do MEG3 a responsável, pois os “Knockouts” causam a eliminação da sequência do DNA do gene MEG3 (incluindo também sequências adjacentes), e, portanto, a atribuição do impacto somente ao lncRNA transcrito por esta região não é correta. Desta forma, o principal objetivo desta dissertação é averiguar o papel deste lncRNA na regulação do ”imprinting” deste domínio e na pluripotência através da modulação dos níveis de expressão deste RNA. Como ponto de partida para o estudo da regulação do “imprinting”, utilizámos iPSCs isogénicas que apresentavam diferentes padrões de metilação no IG-DMR: uma linha iPSC com IG-DMR normal (alelo paterno metilado e alelo materno desmetilado), e outra linha iPSC com IG-DMR hipermetilado (ambos os alelos parentais metilados). Assim, começámos por avaliar o impacto da hipermetilação do IG-DMR no estado de metilação do MEG3-DMR, tal como na expressão do próprio MEG3 e de outros RNAs não codificantes como o lncRNA MEG8. Observámos que a hipermetilação do IG-DMR resultou na hipermetilação do MEG3-DMR, e que nestes casos não havia, como esperado, expressão do lncRNA MEG3, nem do lncRNA MEG8. De seguida, quisemos perceber como estas alterações afetavam o “imprinting” do DLK1, ou seja, se este se tornaria bialélico na linha iPSC com IG-DMR hipermetilado e sem expressão do MEG3. Como esperado, verificou-se que esta linha iPSC apresentava expressão bialélica do DLK1. Contudo, ao contrário da nossa previsão, observámos que a linha iPSC com padrão de metilação normal, exibia também expressão bialélica do DLK1. Enquanto esta investigação decorria, um estudo recentemente publicado sobre células estaminais embrionárias de ratinho permitiu-nos entender este resultado inesperado. Nesse estudo foi descrito que células no estádio estaminal expressavam bialelicamente um nível muito baixo de Dlk1, e que apenas durante a diferenciação neuronal é que os níveis de expressão do Dlk1 aumentavam no alelo paterno, sendo que no alelo materno os níveis se mantinham sempre muito baixos através de um mecanismo de regulação que possivelmente envolve o lncRNA Meg3. Neste sentido, o passo seguinte foi induzir a diferenciação neuronal nas iPSCs para avaliar se ocorria o aumento da expressão do DLK1 e, se na ausência do MEG3, a expressão se tornava bialélica. Observámos que efetivamente, havia um pico de expressão muito significativo no dia 17 da diferenciação e que na linha celular hipermetilada e sem expressão do MEG3, a expressão era claramente bialélica, enquanto que na linha celular com padrão e expressão de MEG3 normais, os resultados indicaram, preferencialmente, uma tendência para a expressão do alelo paterno. Pensamos que esta tendência apenas não foi traduzida numa expressão claramente monoalélica, devido ao facto de dentro do conjunto de células analisadas a maioria ter uma expressão monoalélica do DLK1, enquanto que a minoria restante pudesse ter expressão bialélica devida a uma incorreção do estado de metilação do IG-DMR. A nossa análise na linha iPSC com IG-DMR hipermetilado e sem expressão do MEG3 é coerente com a possibilidade do lncRNA MEG3 ter um papel fulcral na regulação do “imprinting” e, como consequência, na pluripotência das iPSCs. Para entendermos especificamente o papel desempenhado pelo lncRNA MEG3 no “imprinting”, decidimos silenciar a expressão deste lncRNA. Para tal, utilizámos “Antisense Locked Nucleic Acids (LNA) GapmeRs”, que demonstrámos serem uma ferramenta bastante eficiente no silenciamento da expressão do MEG3 em iPSCs indiferenciadas. Verificámos que a par do silenciamento do lncRNA MEG3, também o lncRNA MEG8 foi silenciado, o que contribuí para a ideia de que ambos fazem parte da mesma unidade de transcrição policistrónica. Em seguida, decidimos realizar a experiência do silenciamento do MEG3 no dia 17 da diferenciação neuronal na linha iPSC com preponderância de expressão do DLK1 a partir do alelo paterno. O propósito desta experiência foi entender se o silenciamento do lncRNA MEG3 revertia a expressão maioritariamente paterna em expressão bialélica, onde ambos os alelos parentais se expressassem de forma equitativa. Infelizmente, esta experiência não funcionou por motivos técnicos, muito provavelmente, devido à natureza e densidade celulares durante este estádio de diferenciação. Por essa razão, decidimos então proceder ao silenciamento do MEG3 em fibroblastos, as únicas células estudadas sobre as quais sabíamos que o DLK1 era exclusivamente expresso pelo cromossoma paterno. Nesta experiência, o silenciamento do MEG3 foi muito eficaz (<5% da expressão normal) e levou a uma reativação modesta do alelo materno do DLK1. Este resultado sugere a participação de RNAs não codificantes como o MEG3 ou mesmo o MEG8, também silenciado nesta experiência, na regulação do “imprinting” deste gene. Em suma, com este trabalho foi possível testar pela primeira vez o impacto real do lncRNA MEG3 na regulação do “imprinting” do domínio DLK1-DIO3. Os resultados aqui apresentados, sugerem que o MEG3 e/ou outros RNAs não codificantes expressos no alelo materno, como, por exemplo, o MEG8, podem ter um papel importante na regulação do “imprinting” em todo o domínio. No futuro, será interessante investigar através da abordagem de silenciamento com LNAs GapmeRs contra o MEG3 ou até mesmo contra o MEG8, o impacto noutras linhas celulares com níveis mais abundantes de expressão monoalélica do DLK1. Também será importante estudar os mecanismos de atuação destes e de outros lncRNAs, de modo a garantir a manutenção correta do “imprinting” neste locus.