Publicação

Investigation of novel compounds to prevent TrkB-FL cleavage

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A doença de Alzheimer (AD) é uma das doenças neurodegenerativas mais comuns, sendo expectável que a sua prevalência triplique até 2050, em todo o mundo. Nesta doença ocorre atrofia e perda de processos neuronais com redução do volume cerebral, afetando primeiramente a região do hipocampo - a qual desempenha um papel fundamental na memória e na aprendizagem. As principais caraterísticas patológicas da AD envolvem as placas extracelulares, formadas pela acumulação anormal de péptidos β-amilóide (Aβ), e as tranças neurofibrilares intracelulares, resultantes da agregação intracelular da proteína Tau hiperfosforilada. Os fatores de risco associados à AD envolvem fatores genéticos e outros, como a idade e os diabetes. De acordo com os fatores genéticos, as mutações que ocorrem no gene da proteína percursora amilóide (APP), apesar de serem raras, representam um dos tipos de AD, a AD de início precoce – em que os sintomas se manifestam em doentes com menos de 65 anos. Enquanto, a AD de início tardio (mais de 65 anos) está associada às mutações na apolipoproteína E (ApoE), e representa mais de 94% de todos os casos de AD. O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é uma das neurotrofinas expressas no sistema nervoso, ativando preferencialmente o recetor tropomiosona quinase B (TrkB) e regulando, assim, vários aspetos do sistema nervoso central e periférico. No entanto, na AD, a acumulação de Aβ leva a um aumento dos níveis de cálcio (Ca2+) intracelulares através da ativação dos recetores extrasinápticos de N-metil-D-aspartato (eNMDAR), ativando assim as calpaínas. Estas enzimas são responsáveis pela clivagem da isoforma de comprimento total do recetor TrkB (TrkB-FL), levando à formação de uma nova isoforma truncada do recetor TrkB (TrkB-T’) e de um fragmento de domínio intracelular (TrkB-ICD). Os recetores truncados têm sido vistos como moduladores negativos da sinalização BDNF/TrkB-FL, sendo expectável que a nova isoforma (TrkB-T’) também desempenhe semelhante função. Por outro lado, o fragmento TrkB-ICD acumula-se no núcleo, desregulando a atividade de proteínas axonais e nucleares. A disfunção da via BDNF/TrkB-FL impede a ativação de vias de sinalização intracelulares mediadas pelo BDNF, as quais promovem a diferenciação neuronal, sobrevivência celular e a plasticidade sináptica. Deste modo, é necessário proteger esta importante via neuroprotetora. Na tentativa de prevenir a clivagem do recetor TrkB-FL, o nosso grupo tem trabalhado num potencial candidato, o péptido TAT-TrkB. Este péptido é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica (BBB), prevenir a clivagem do recetor TrkB-FL e reestabelecer a sinalização do BDNF – atuando possivelmente como um composto “engodo”. Contudo, podem existir problemas associados aos péptidos, como instabilidade, toxicidade e curto tempo de meia-vida. Deste modo, o nosso grupo começou uma pesquisa por novas pequenas moléculas na tentativa de encontrar compostos não-péptidos capazes de prevenir a clivagem do recetor TrkB-FL. A partir da construção do modelo estrutural do recetor TrkB-FL, baseada na sequência do recetor e na sua comparação com estruturas de proteínas determinadas experimentalmente, descobrimos um “pocket” localizado perto do centro do local de clivagem – onde se poderiam ligar inibidores moleculares. A seleção dos 50 melhores compostos químicos foi feita tendo em conta os seguintes critérios: melhor função de Gibbs, a capacidade de atravessar a BBB, a solubilidade, a absorção gastrointestinal, a menor interferência com citocromos e a ausência de patente. Considerando o recente trabalho desenvolvido no nosso grupo, o objetivo principal deste trabalho foi investigar a capacidade de 3 pequenas moléculas, contempladas na lista de 50 melhores compostos, protegerem a sinalização mediada pelo BDNF ao impedir a clivagem do recetor TrkB-FL. Os 3 compostos selecionados foram denominados de compostos F, G e H, e utilizados em 4 concentrações diferentes, nomeadamente a 25, 50, 100 e 1000 nM. Os compostos F, G e H foram primeiramente adicionados a culturas neuronais neocorticais primárias preparadas a partir de fetos de ratos Sprague Dawley com 18 dias de gestação, com o intuito de avaliar, em condições fisiológicas e tóxicas, o seu efeito na prevenção da clivagem do recetor TrkB-FL. Nos resultados obtidos em condições fisiológicas, a presença dos compostos selecionados (F, G e H) não mostrou diferenças significativas nos níveis proteicos de TrkB-FL, TrkB-ICD e de rácio TrkB-ICD/TrkB-FL, em todas as concentrações – comparativamente à condição controlo. Para avaliar se os compostos poderiam afetar a transmissão sináptica, foram preparadas fatias de hipocampo de ratos machos Sprague Dawley e registados os potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo (fEPSPs). Nos resultados ex vivo obtidos não foram encontradas alterações significativas nos fEPSPs em fatias de hipocampo. Contudo, na presença do composto F na concentração de 100 e 1000 nM, foi observado um aumento significativo no declive dos fEPSPs – em comparação com a condição controlo. Assim, os resultados sugerem que o composto F nas concentrações mencionadas anteriormente afeta a transmissão sináptica hipocampal em condições fisiológicas. Complementarmente aos resultados obtidos em condições fisiológicas, o estudo in vitro do efeito dos compostos F, G e H na clivagem do recetor TrkB-FL em condições tóxicas, foi fundamental. Na presença dos compostos F e G, co-incubados com Aβ, não foram encontradas alterações significativas nos níveis proteicos TrkB-FL, TrkB-ICD e de rácio TrkB-ICD/TrkB-FL – quando comparados com a condição Aβ. Ainda, na co-incubação do composto H com Aβ, não foram observadas diferenças significativas nos níveis proteicos TrkB-FL e TrkB-ICD, nas concentrações de 25, 50 e 100 nM. Apesar disso, foi observada uma diminuição significativa dos níveis proteicos de rácio TrkB-ICD/TrkB-FL, na presença do composto H na concentração de 1000 nM, co-incubado com Aβ. Tendo em conta os resultados obtidos, o composto H foi considerado o candidato mais promissor na prevenção da clivagem do recetor TrkB-FL e da consequente formação do recetor TrkB-T’ e do TrkB-ICD. De modo a perceber se a presença do composto H apresentava algum tipo de interferência no normal funcionamento do sistema BDNF/TrkB-FL, o efeito deste composto promissor na sinalização mediada pelo BDNF foi avaliado. Para todas as concentrações testadas (25, 50, 100 e 1000 nM), o composto H co-incubado com BDNF, não mostrou alterações significativas nos níveis proteicos da fosforilação do resíduo de tirosina kinase 515 (Y515), comparativamente com a condição com BDNF. Ou seja, a presença do composto H possivelmente não interfere com a fosforilação dos resíduos tirosina quinase presentes na região intracelular do recetor TrkB-FL, uma vez que não afeta a normal sinalização molecular mediada pelo BDNF. Por outro lado, para avaliar o efeito do composto H na plasticidade sináptica, foram realizadas experiências de eletrofisiologia. Na indução da potenciação de longa duração (LTP) a presença do composto H, na concentração de 1000 nM, não levou a diferenças significativas nos fEPSPs em fatias de hipocampo de ratos machos Sprague Dawley – indicando que este composto promissor não afeta a plasticidade sináptica em condições fisiológicas. Na tentativa de perceber como o composto H previne a clivagem do recetor TrkB-FL, foi avaliada uma possível interação entre este composto promissor e as calpaínas. Devido ao reduzido número de experiências, ainda não é possível inferir se este composto previne a clivagem do recetor TrkB-FL sem perturbar a atividade destas enzimas – sendo necessário uma investigação mais aprofundada de modo a retirar conclusões sólidas sobre esta possível interação. Em conclusão, a ligação do composto H ao recetor TrkB-FL no seu sítio de clivagem previne a clivagem deste recetor em condições tóxicas. Além disso, a presença desta pequena molécula não afeta a transmissão sináptica basal ou a plasticidade sináptica. A fosforilação do recetor TrkB-FL também não é afetada pelo composto H – sendo uma etapa fundamental para as ações mediadas pelo BDNF.
Autores principais:	Fernandes, Lia Marta Barreira
Assunto:	Doença de Alzheimer Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) Pequenas moléculas Receptor TrkB-FL Prevenção da clivagem Teses de mestrado - 2022
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A doença de Alzheimer (AD) é uma das doenças neurodegenerativas mais comuns, sendo expectável que a sua prevalência triplique até 2050, em todo o mundo. Nesta doença ocorre atrofia e perda de processos neuronais com redução do volume cerebral, afetando primeiramente a região do hipocampo - a qual desempenha um papel fundamental na memória e na aprendizagem. As principais caraterísticas patológicas da AD envolvem as placas extracelulares, formadas pela acumulação anormal de péptidos β-amilóide (Aβ), e as tranças neurofibrilares intracelulares, resultantes da agregação intracelular da proteína Tau hiperfosforilada. Os fatores de risco associados à AD envolvem fatores genéticos e outros, como a idade e os diabetes. De acordo com os fatores genéticos, as mutações que ocorrem no gene da proteína percursora amilóide (APP), apesar de serem raras, representam um dos tipos de AD, a AD de início precoce – em que os sintomas se manifestam em doentes com menos de 65 anos. Enquanto, a AD de início tardio (mais de 65 anos) está associada às mutações na apolipoproteína E (ApoE), e representa mais de 94% de todos os casos de AD. O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é uma das neurotrofinas expressas no sistema nervoso, ativando preferencialmente o recetor tropomiosona quinase B (TrkB) e regulando, assim, vários aspetos do sistema nervoso central e periférico. No entanto, na AD, a acumulação de Aβ leva a um aumento dos níveis de cálcio (Ca2+) intracelulares através da ativação dos recetores extrasinápticos de N-metil-D-aspartato (eNMDAR), ativando assim as calpaínas. Estas enzimas são responsáveis pela clivagem da isoforma de comprimento total do recetor TrkB (TrkB-FL), levando à formação de uma nova isoforma truncada do recetor TrkB (TrkB-T’) e de um fragmento de domínio intracelular (TrkB-ICD). Os recetores truncados têm sido vistos como moduladores negativos da sinalização BDNF/TrkB-FL, sendo expectável que a nova isoforma (TrkB-T’) também desempenhe semelhante função. Por outro lado, o fragmento TrkB-ICD acumula-se no núcleo, desregulando a atividade de proteínas axonais e nucleares. A disfunção da via BDNF/TrkB-FL impede a ativação de vias de sinalização intracelulares mediadas pelo BDNF, as quais promovem a diferenciação neuronal, sobrevivência celular e a plasticidade sináptica. Deste modo, é necessário proteger esta importante via neuroprotetora. Na tentativa de prevenir a clivagem do recetor TrkB-FL, o nosso grupo tem trabalhado num potencial candidato, o péptido TAT-TrkB. Este péptido é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica (BBB), prevenir a clivagem do recetor TrkB-FL e reestabelecer a sinalização do BDNF – atuando possivelmente como um composto “engodo”. Contudo, podem existir problemas associados aos péptidos, como instabilidade, toxicidade e curto tempo de meia-vida. Deste modo, o nosso grupo começou uma pesquisa por novas pequenas moléculas na tentativa de encontrar compostos não-péptidos capazes de prevenir a clivagem do recetor TrkB-FL. A partir da construção do modelo estrutural do recetor TrkB-FL, baseada na sequência do recetor e na sua comparação com estruturas de proteínas determinadas experimentalmente, descobrimos um “pocket” localizado perto do centro do local de clivagem – onde se poderiam ligar inibidores moleculares. A seleção dos 50 melhores compostos químicos foi feita tendo em conta os seguintes critérios: melhor função de Gibbs, a capacidade de atravessar a BBB, a solubilidade, a absorção gastrointestinal, a menor interferência com citocromos e a ausência de patente. Considerando o recente trabalho desenvolvido no nosso grupo, o objetivo principal deste trabalho foi investigar a capacidade de 3 pequenas moléculas, contempladas na lista de 50 melhores compostos, protegerem a sinalização mediada pelo BDNF ao impedir a clivagem do recetor TrkB-FL. Os 3 compostos selecionados foram denominados de compostos F, G e H, e utilizados em 4 concentrações diferentes, nomeadamente a 25, 50, 100 e 1000 nM. Os compostos F, G e H foram primeiramente adicionados a culturas neuronais neocorticais primárias preparadas a partir de fetos de ratos Sprague Dawley com 18 dias de gestação, com o intuito de avaliar, em condições fisiológicas e tóxicas, o seu efeito na prevenção da clivagem do recetor TrkB-FL. Nos resultados obtidos em condições fisiológicas, a presença dos compostos selecionados (F, G e H) não mostrou diferenças significativas nos níveis proteicos de TrkB-FL, TrkB-ICD e de rácio TrkB-ICD/TrkB-FL, em todas as concentrações – comparativamente à condição controlo. Para avaliar se os compostos poderiam afetar a transmissão sináptica, foram preparadas fatias de hipocampo de ratos machos Sprague Dawley e registados os potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo (fEPSPs). Nos resultados ex vivo obtidos não foram encontradas alterações significativas nos fEPSPs em fatias de hipocampo. Contudo, na presença do composto F na concentração de 100 e 1000 nM, foi observado um aumento significativo no declive dos fEPSPs – em comparação com a condição controlo. Assim, os resultados sugerem que o composto F nas concentrações mencionadas anteriormente afeta a transmissão sináptica hipocampal em condições fisiológicas. Complementarmente aos resultados obtidos em condições fisiológicas, o estudo in vitro do efeito dos compostos F, G e H na clivagem do recetor TrkB-FL em condições tóxicas, foi fundamental. Na presença dos compostos F e G, co-incubados com Aβ, não foram encontradas alterações significativas nos níveis proteicos TrkB-FL, TrkB-ICD e de rácio TrkB-ICD/TrkB-FL – quando comparados com a condição Aβ. Ainda, na co-incubação do composto H com Aβ, não foram observadas diferenças significativas nos níveis proteicos TrkB-FL e TrkB-ICD, nas concentrações de 25, 50 e 100 nM. Apesar disso, foi observada uma diminuição significativa dos níveis proteicos de rácio TrkB-ICD/TrkB-FL, na presença do composto H na concentração de 1000 nM, co-incubado com Aβ. Tendo em conta os resultados obtidos, o composto H foi considerado o candidato mais promissor na prevenção da clivagem do recetor TrkB-FL e da consequente formação do recetor TrkB-T’ e do TrkB-ICD. De modo a perceber se a presença do composto H apresentava algum tipo de interferência no normal funcionamento do sistema BDNF/TrkB-FL, o efeito deste composto promissor na sinalização mediada pelo BDNF foi avaliado. Para todas as concentrações testadas (25, 50, 100 e 1000 nM), o composto H co-incubado com BDNF, não mostrou alterações significativas nos níveis proteicos da fosforilação do resíduo de tirosina kinase 515 (Y515), comparativamente com a condição com BDNF. Ou seja, a presença do composto H possivelmente não interfere com a fosforilação dos resíduos tirosina quinase presentes na região intracelular do recetor TrkB-FL, uma vez que não afeta a normal sinalização molecular mediada pelo BDNF. Por outro lado, para avaliar o efeito do composto H na plasticidade sináptica, foram realizadas experiências de eletrofisiologia. Na indução da potenciação de longa duração (LTP) a presença do composto H, na concentração de 1000 nM, não levou a diferenças significativas nos fEPSPs em fatias de hipocampo de ratos machos Sprague Dawley – indicando que este composto promissor não afeta a plasticidade sináptica em condições fisiológicas. Na tentativa de perceber como o composto H previne a clivagem do recetor TrkB-FL, foi avaliada uma possível interação entre este composto promissor e as calpaínas. Devido ao reduzido número de experiências, ainda não é possível inferir se este composto previne a clivagem do recetor TrkB-FL sem perturbar a atividade destas enzimas – sendo necessário uma investigação mais aprofundada de modo a retirar conclusões sólidas sobre esta possível interação. Em conclusão, a ligação do composto H ao recetor TrkB-FL no seu sítio de clivagem previne a clivagem deste recetor em condições tóxicas. Além disso, a presença desta pequena molécula não afeta a transmissão sináptica basal ou a plasticidade sináptica. A fosforilação do recetor TrkB-FL também não é afetada pelo composto H – sendo uma etapa fundamental para as ações mediadas pelo BDNF.