Publicação

Determinação da atividade de fatores de virulência em estirpes de Streptococcus pyogenes isoladas de diferentes tipos de infeção

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Streptococcus pyogenes (Streptococcus do grupo A de Lancefield, GAS) é um dos agentes patogénicos mais comuns do ser humano, podendo causar faringoamigdalite, infeções superficiais da pele e tecidos moles e infeções invasivas. Em Portugal, estudos epidemiológicos prévios concluíram que a população de GAS possuía uma elevada diversidade genética, embora algumas linhagens estivessem significativamente sobre- ou sub-representadas em determinados tipos de infeção. Num conjunto de 68 estirpes representativo da diversidade genética e fenotípica de seis linhagens de interesse, pretendeu-se determinar a atividade de NAD-glicohidrolase (NADase), estreptolisina O (SLO) e estreptolisina S (SLS), para tentar identificar características genotípicas e fenotípicas relacionadas com a atividade destes fatores de virulência, que pudessem contribuir para a associação preferencial dessas linhagens com certos tipos de infeção. Como se pretendia determinar as atividades destes fatores de virulência a partir de sobrenadantes de culturas em fase exponencial tardia, foi necessário definir as curvas de crescimento das estirpes em estudo. De forma a simplificar o procedimento experimental de determinação de atividade, também se testou a possibilidade de realizar estes ensaios a partir de sobrenadantes de fase exponencial tardia previamente recolhidos e congelados a -80ºC. Como a congelação não interferiu com a atividade de NADase, SLO e SLS nos períodos de congelação testados (até seis meses de congelação), foi adotado este procedimento nos ensaios seguintes de determinação de atividade. Os ensaios de determinação de atividade foram executados com base em protocolos previamente utilizados no laboratório. No entanto, para confirmar que nas experiências de determinação da atividade de SLO e de SLS só estava a ser detetada a atividade do respetivo fator, sem interferência da outra estreptolisina, foi testada a atividade destes fatores na presença de colesterol (inibidor da SLO) ou de azul de tripano (inibidor da SLS), respetivamente. Foi possível concluir que a concentração de azul de tripano utilizada não era suficiente para inibir a atividade hemolítica de SLS, podendo assim existir alguma atividade hemolítica residual deste fator, nos ensaios de determinação da atividade de SLO. Apesar de se ter tentado otimizar a concentração deste reagente, no período de execução experimental desta dissertação, não foi possível concluir qual a concentração ideal a ser utilizada. Como tal, as atividades de SLO e SLS não foram determinadas para o conjunto completo de 68 estirpes, visto ser necessário terminar a otimização dos respetivos ensaios. No período de execução experimental desta dissertação, só foi possível concluir a determinação da atividade de NADase para o conjunto de estirpes pertencentes ao tipo emm89 (n=16). As atividades medidas estão de acordo com a literatura, corroborando uma maior atividade de NADase das estirpes pertencentes ao clade 3 (linhagem emm89-hasABC-), relativamente às dos clades 1 e 2 (linhagens emm89-hasABC+). No entanto, é importante realçar que a diferença observada entre níveis de atividade de linhagens distintas foi apenas de uma ordem de diluição. Como tal, poderão existir outros fatores a contribuir para o sucesso do clade 3 a nível mundial. Verificou-se também uma atividade de NADase superior nas estirpes com mutações no sistema de regulação CovRS, o que está de acordo com o facto deste sistema de regulação contribuir para a repressão do operão que codifica a NADase e a SLO. Deste modo, apesar de terem sido retiradas algumas conclusões quanto à atividade de NADase das estirpes do tipo emm89, para estabelecer correlações entre os níveis de atividade dos três fatores de virulência e características genéticas das estirpes ou tipos de infeção, será necessário determinar a atividade dos mesmos nas restantes linhagens genéticas, após otimização dos ensaios de atividade de SLO e SLS.
Autores principais:	Esteves, Beatriz Gonçalves
Assunto:	Streptococcus pyogenes NAD+ nucleosidase Estreptolisina O Estreptolisina S emm89 Tese de mestrado - 2022
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	português
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Streptococcus pyogenes (Streptococcus do grupo A de Lancefield, GAS) é um dos agentes patogénicos mais comuns do ser humano, podendo causar faringoamigdalite, infeções superficiais da pele e tecidos moles e infeções invasivas. Em Portugal, estudos epidemiológicos prévios concluíram que a população de GAS possuía uma elevada diversidade genética, embora algumas linhagens estivessem significativamente sobre- ou sub-representadas em determinados tipos de infeção. Num conjunto de 68 estirpes representativo da diversidade genética e fenotípica de seis linhagens de interesse, pretendeu-se determinar a atividade de NAD-glicohidrolase (NADase), estreptolisina O (SLO) e estreptolisina S (SLS), para tentar identificar características genotípicas e fenotípicas relacionadas com a atividade destes fatores de virulência, que pudessem contribuir para a associação preferencial dessas linhagens com certos tipos de infeção. Como se pretendia determinar as atividades destes fatores de virulência a partir de sobrenadantes de culturas em fase exponencial tardia, foi necessário definir as curvas de crescimento das estirpes em estudo. De forma a simplificar o procedimento experimental de determinação de atividade, também se testou a possibilidade de realizar estes ensaios a partir de sobrenadantes de fase exponencial tardia previamente recolhidos e congelados a -80ºC. Como a congelação não interferiu com a atividade de NADase, SLO e SLS nos períodos de congelação testados (até seis meses de congelação), foi adotado este procedimento nos ensaios seguintes de determinação de atividade. Os ensaios de determinação de atividade foram executados com base em protocolos previamente utilizados no laboratório. No entanto, para confirmar que nas experiências de determinação da atividade de SLO e de SLS só estava a ser detetada a atividade do respetivo fator, sem interferência da outra estreptolisina, foi testada a atividade destes fatores na presença de colesterol (inibidor da SLO) ou de azul de tripano (inibidor da SLS), respetivamente. Foi possível concluir que a concentração de azul de tripano utilizada não era suficiente para inibir a atividade hemolítica de SLS, podendo assim existir alguma atividade hemolítica residual deste fator, nos ensaios de determinação da atividade de SLO. Apesar de se ter tentado otimizar a concentração deste reagente, no período de execução experimental desta dissertação, não foi possível concluir qual a concentração ideal a ser utilizada. Como tal, as atividades de SLO e SLS não foram determinadas para o conjunto completo de 68 estirpes, visto ser necessário terminar a otimização dos respetivos ensaios. No período de execução experimental desta dissertação, só foi possível concluir a determinação da atividade de NADase para o conjunto de estirpes pertencentes ao tipo emm89 (n=16). As atividades medidas estão de acordo com a literatura, corroborando uma maior atividade de NADase das estirpes pertencentes ao clade 3 (linhagem emm89-hasABC-), relativamente às dos clades 1 e 2 (linhagens emm89-hasABC+). No entanto, é importante realçar que a diferença observada entre níveis de atividade de linhagens distintas foi apenas de uma ordem de diluição. Como tal, poderão existir outros fatores a contribuir para o sucesso do clade 3 a nível mundial. Verificou-se também uma atividade de NADase superior nas estirpes com mutações no sistema de regulação CovRS, o que está de acordo com o facto deste sistema de regulação contribuir para a repressão do operão que codifica a NADase e a SLO. Deste modo, apesar de terem sido retiradas algumas conclusões quanto à atividade de NADase das estirpes do tipo emm89, para estabelecer correlações entre os níveis de atividade dos três fatores de virulência e características genéticas das estirpes ou tipos de infeção, será necessário determinar a atividade dos mesmos nas restantes linhagens genéticas, após otimização dos ensaios de atividade de SLO e SLS.