Publicação

Cancer stem cell markers in triple-negative breast cancer : a comparison between patient biopsies and cancer cell models

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Introdução: O cancro da mama (CM) é o tipo de cancro mais frequentemente diagnosticado nas mulheres, sendo o cancro da mama triplo-negativo (CMTN) responsável por cerca de 10- 20% dos casos. O CMTN afeta predominantemente mulheres mais jovens e é caracterizado por ter um mau prognóstico, perfil agressivo e opções terapêuticas limitadas. A descoberta das células estaminais cancerígenas (CEC) no microambiente tumoral, particularmente através da via Wnt/β-catenina e da sobreexpressão dos recetores Frizzled (FZD), melhorou a compreensão da resistência do cancro às várias terapêuticas e da tendência para a metastização. Este estudo visa identificar e caracterizar as CEC e avaliar a expressão do recetor FZD7 em vários modelos pré-clínicos e em biópsias de doentes. Metodologia: Uma revisão bibliográfica abrangente permitiu identificar marcadores característicos de CEC. Foram selecionadas amostras de doentes com CMTN (quatro amostras de tumores primários e uma metastática cerebral) e linhas celulares de CMTN. Foram obtidos anticorpos para os marcadores das CEC selecionados e anti-FZD7. As linhas celulares de CMTN cultivadas em monocamada e em esferoide foram caracterizadas por citometria de fluxo, enquanto as biópsias de doentes, linhas celulares de CMTN em esferoides foram caracterizadas por imunohistoquímica. Comparações foram feitas com tecido mamário saudável sempre que possível. Resultados: A citometria de fluxo revelou uma intensidade de fluorescência elevada para o marcador CD44 em todas as linhas celulares, com maior expressão em culturas com estrutura tridimensional, comparativamente às culturas em monocamada. O CD133 mostrou uma expressão mínima em células representativas do tecido mamário normal, com níveis aumentados em esferoides constituídos por células de linhas celulares tumorais. Os marcadores BCRP/ABCG2 e FZD7 foram minimamente expressos nas células representativas do tecido mamário normal, mas elevados em células com fenótipo mais agressivo e cultivadas em três dimensões. A imunohistoquímica confirmou estes achados, demonstrando uma forte marcação para CD44, BCRP/ABCG2 e FZD7 em amostras de CMTN e metástases cerebrais, enquanto a expressão do CD133 foi limitada. Discussão: O CMTN, embora não seja o subtipo mais prevalente de cancro da mama, representa uma taxa significativa de mortalidade. Isto estimulou numerosas investigações destinadas a compreender o motivo pelo qual o prognóstico para este subtipo de cancro é significativamente pior em comparação com outros. Ao longo dos anos, comprovou-se que este subtipo molecular é particularmente enriquecido numa população de células agora identificada como CEC. As CEC exibem características fisiopatológicas distintas, tais como o seu estado quiescente e a sua resistência aos tratamentos convencionais, como a quimioterapia e radioterapia. Estudos recentes têm-se focado não só em otimizar a deteção desta população celular através do uso de múltiplos marcadores celulares, mas também no desenvolvimento de fármacos que tenham como alvo as vias celulares sobreexpressas que possam contribuir para o fenótipo agressivo e resiliente desta população. Assim sendo, a nossa pesquisa centrou-se na avaliação da expressão dos marcadores CD44, CD133, BCRP/ABCG2 e FZD7 em linhas celulares, quatro amostras de tumores primários de CMTN e o tecido saudável circundante correspondente, e uma amostra de uma metástase cerebral de CMTN. Os nossos resultados corroboraram vários aspetos previamente descritos na literatura, incluindo a expressão pronunciada do marcador CD44 em células de CMTN. Este facto foi evidenciado pelos valores obtidos na citometria de fluxo para as linhas celulares BT- 20 e MDA-MB-231 e pela deteção por imunohistoquímica deste marcador nos esferoides formados por estas linhas celulares e nas amostras de CMTN. Em relação ao tecido saudável, conforme descrito noutros trabalhos, existe a presença de células CD44+ em torno da área tumoral, mesmo na ausência de células neoplásicas. Adicionalmente, o nosso estudo demonstrou que, usando a linha celular MCF-10A - representativa do tecido mamário normal - observámos níveis significativamente altos de CD44 em comparação com outros marcadores. Isto pode ser atribuído às funções fisiológicas deste marcador no tecido, confirmando que este não é exclusivamente um marcador de atividade tumoral. No que diz respeito ao marcador CD133, tradicionalmente descrito em estudos de CEC de CMTN, antecipávamos uma expressão inequívoca tanto nas amostras de tumores primários como nas linhas celulares representativas de CMTN. No entanto, o que observámos foi uma expressão mínima na linha celular MCF-10A e um aumento na linha MDA-MB-231, embora muito inferior ao observado com os marcadores BCRP/ABCG2 ou FZD7. Na imunohistoquímica das amostras de tumores primários, a expressão do CD133 foi rara e, quando presente, fraca. Estes resultados contradizem as nossas expectativas, pois outros estudos relataram a expressão de CD133 em cerca de 43% das amostras de CMTN. Esta discrepância pode derivar da nossa amostra reduzida, composta por apenas quatro amostras, porque, quando examinámos o modelo celular mais representativo do ambiente tumoral — células MDA-MB- 231 cultivadas em esferoides — observámos níveis de marcadores significativamente diferentes daqueles na linha celular normal. Quanto ao marcador BCRP/ABCG2, obtivemos resultados consistentes com a literatura, com uma expressão aumentada em amostras de tumores primários de CMTN e uma expressão mais pronunciada na amostra com estadio de doença mais avançado — estadio T3N3a pósquimioterapia neoadjuvante. Este marcador revelou-se promissor, pois não mostrou expressão no tecido saudável circundante, facto corroborado pela citometria de fluxo com linhas celulares. Neste ensaio, observámos uma expressão significativamente menor na linha MCF-10A comparativamente às células MDA-MB-231 cultivadas em esferoides. Finalmente, no que diz respeito ao recetor FZD7, este apresentou um padrão semelhante ao do marcador BCRP/ABCG2, com expressão moderada a forte em amostras de tumores primários e sem expressão significativa no tecido saudável circundante das amostras correspondentes. No estudo das linhas celulares, observámos um comportamento quase idêntico ao do marcador anterior, com expressão significativamente menor na linha MCF-10A em comparação com as linhas BT-20 e MDA-MB-231 cultivadas em três dimensões. Em relação à amostra de metástase cerebral, dado o nosso conhecimento sobre a quimiorresistência das CEC e a sua propensão para resistir a tratamentos e espalhar-se para outras regiões do corpo, sob a forma de metástases, a nossa análise por imunohistoquímica revelou um aumento óbvio e significativo na expressão de todos os marcadores estudados, particularmente dos marcadores CD44 e FZD7. Estes dados abrem várias portas para estudos futuros. Seria de interesse otimizar a deteção da subpopulação de CEC em CMTN, já que isso ainda não foi totalmente alcançado. Estudos futuros poderiam envolver o isolamento de subpopulações de células CD44+/ABCG2+ para determinar o número esperado de CEC de forma mais precisa num tumor, uma população descrita como consideravelmente limitada. Conclusão: Este estudo evidenciou o papel dos marcadores de CEC na patologia do CMTN. Os nossos achados confirmam a expressão significativa e crescente de CD44 no tecido mamário saudável, nas amostras de CMTN primário e na amostra de metástase cerebral de CMTN. Em relação ao marcador CD133, apesar de não obtermos os resultados esperados nas amostras de tumor primário, conseguimos observar diferenças significativas na expressão deste marcador ao nível das linhas celulares. A expressão aumentada de BCRP/ABCG2 e FZD7 no CMTN, em comparação com o tecido saudável, sublinha o seu envolvimento na resistência a fármacos e na ativação da via Wnt-β-catenina, respetivamente. Estes achados podem ser úteis na compreensão das características das CEC no CMTN e destacam potenciais alvos para intervenção terapêutica. Estudos futuros devem focar-se em aumentar a amostra analisada e em uniformizar as técnicas de preservação de amostras, de modo a validar estes achados e explorar de forma mais eficiente as terapias direcionadas a CEC no CMTN.
Autores principais:	Vieira, Ana Margarida Novais da Costa
Assunto:	Cancro da mama triplo-negativo Células estaminais cancerígenas Recetor frizzled Bioquímica
Ano:	2024
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Introdução: O cancro da mama (CM) é o tipo de cancro mais frequentemente diagnosticado nas mulheres, sendo o cancro da mama triplo-negativo (CMTN) responsável por cerca de 10- 20% dos casos. O CMTN afeta predominantemente mulheres mais jovens e é caracterizado por ter um mau prognóstico, perfil agressivo e opções terapêuticas limitadas. A descoberta das células estaminais cancerígenas (CEC) no microambiente tumoral, particularmente através da via Wnt/β-catenina e da sobreexpressão dos recetores Frizzled (FZD), melhorou a compreensão da resistência do cancro às várias terapêuticas e da tendência para a metastização. Este estudo visa identificar e caracterizar as CEC e avaliar a expressão do recetor FZD7 em vários modelos pré-clínicos e em biópsias de doentes. Metodologia: Uma revisão bibliográfica abrangente permitiu identificar marcadores característicos de CEC. Foram selecionadas amostras de doentes com CMTN (quatro amostras de tumores primários e uma metastática cerebral) e linhas celulares de CMTN. Foram obtidos anticorpos para os marcadores das CEC selecionados e anti-FZD7. As linhas celulares de CMTN cultivadas em monocamada e em esferoide foram caracterizadas por citometria de fluxo, enquanto as biópsias de doentes, linhas celulares de CMTN em esferoides foram caracterizadas por imunohistoquímica. Comparações foram feitas com tecido mamário saudável sempre que possível. Resultados: A citometria de fluxo revelou uma intensidade de fluorescência elevada para o marcador CD44 em todas as linhas celulares, com maior expressão em culturas com estrutura tridimensional, comparativamente às culturas em monocamada. O CD133 mostrou uma expressão mínima em células representativas do tecido mamário normal, com níveis aumentados em esferoides constituídos por células de linhas celulares tumorais. Os marcadores BCRP/ABCG2 e FZD7 foram minimamente expressos nas células representativas do tecido mamário normal, mas elevados em células com fenótipo mais agressivo e cultivadas em três dimensões. A imunohistoquímica confirmou estes achados, demonstrando uma forte marcação para CD44, BCRP/ABCG2 e FZD7 em amostras de CMTN e metástases cerebrais, enquanto a expressão do CD133 foi limitada. Discussão: O CMTN, embora não seja o subtipo mais prevalente de cancro da mama, representa uma taxa significativa de mortalidade. Isto estimulou numerosas investigações destinadas a compreender o motivo pelo qual o prognóstico para este subtipo de cancro é significativamente pior em comparação com outros. Ao longo dos anos, comprovou-se que este subtipo molecular é particularmente enriquecido numa população de células agora identificada como CEC. As CEC exibem características fisiopatológicas distintas, tais como o seu estado quiescente e a sua resistência aos tratamentos convencionais, como a quimioterapia e radioterapia. Estudos recentes têm-se focado não só em otimizar a deteção desta população celular através do uso de múltiplos marcadores celulares, mas também no desenvolvimento de fármacos que tenham como alvo as vias celulares sobreexpressas que possam contribuir para o fenótipo agressivo e resiliente desta população. Assim sendo, a nossa pesquisa centrou-se na avaliação da expressão dos marcadores CD44, CD133, BCRP/ABCG2 e FZD7 em linhas celulares, quatro amostras de tumores primários de CMTN e o tecido saudável circundante correspondente, e uma amostra de uma metástase cerebral de CMTN. Os nossos resultados corroboraram vários aspetos previamente descritos na literatura, incluindo a expressão pronunciada do marcador CD44 em células de CMTN. Este facto foi evidenciado pelos valores obtidos na citometria de fluxo para as linhas celulares BT- 20 e MDA-MB-231 e pela deteção por imunohistoquímica deste marcador nos esferoides formados por estas linhas celulares e nas amostras de CMTN. Em relação ao tecido saudável, conforme descrito noutros trabalhos, existe a presença de células CD44+ em torno da área tumoral, mesmo na ausência de células neoplásicas. Adicionalmente, o nosso estudo demonstrou que, usando a linha celular MCF-10A - representativa do tecido mamário normal - observámos níveis significativamente altos de CD44 em comparação com outros marcadores. Isto pode ser atribuído às funções fisiológicas deste marcador no tecido, confirmando que este não é exclusivamente um marcador de atividade tumoral. No que diz respeito ao marcador CD133, tradicionalmente descrito em estudos de CEC de CMTN, antecipávamos uma expressão inequívoca tanto nas amostras de tumores primários como nas linhas celulares representativas de CMTN. No entanto, o que observámos foi uma expressão mínima na linha celular MCF-10A e um aumento na linha MDA-MB-231, embora muito inferior ao observado com os marcadores BCRP/ABCG2 ou FZD7. Na imunohistoquímica das amostras de tumores primários, a expressão do CD133 foi rara e, quando presente, fraca. Estes resultados contradizem as nossas expectativas, pois outros estudos relataram a expressão de CD133 em cerca de 43% das amostras de CMTN. Esta discrepância pode derivar da nossa amostra reduzida, composta por apenas quatro amostras, porque, quando examinámos o modelo celular mais representativo do ambiente tumoral — células MDA-MB- 231 cultivadas em esferoides — observámos níveis de marcadores significativamente diferentes daqueles na linha celular normal. Quanto ao marcador BCRP/ABCG2, obtivemos resultados consistentes com a literatura, com uma expressão aumentada em amostras de tumores primários de CMTN e uma expressão mais pronunciada na amostra com estadio de doença mais avançado — estadio T3N3a pósquimioterapia neoadjuvante. Este marcador revelou-se promissor, pois não mostrou expressão no tecido saudável circundante, facto corroborado pela citometria de fluxo com linhas celulares. Neste ensaio, observámos uma expressão significativamente menor na linha MCF-10A comparativamente às células MDA-MB-231 cultivadas em esferoides. Finalmente, no que diz respeito ao recetor FZD7, este apresentou um padrão semelhante ao do marcador BCRP/ABCG2, com expressão moderada a forte em amostras de tumores primários e sem expressão significativa no tecido saudável circundante das amostras correspondentes. No estudo das linhas celulares, observámos um comportamento quase idêntico ao do marcador anterior, com expressão significativamente menor na linha MCF-10A em comparação com as linhas BT-20 e MDA-MB-231 cultivadas em três dimensões. Em relação à amostra de metástase cerebral, dado o nosso conhecimento sobre a quimiorresistência das CEC e a sua propensão para resistir a tratamentos e espalhar-se para outras regiões do corpo, sob a forma de metástases, a nossa análise por imunohistoquímica revelou um aumento óbvio e significativo na expressão de todos os marcadores estudados, particularmente dos marcadores CD44 e FZD7. Estes dados abrem várias portas para estudos futuros. Seria de interesse otimizar a deteção da subpopulação de CEC em CMTN, já que isso ainda não foi totalmente alcançado. Estudos futuros poderiam envolver o isolamento de subpopulações de células CD44+/ABCG2+ para determinar o número esperado de CEC de forma mais precisa num tumor, uma população descrita como consideravelmente limitada. Conclusão: Este estudo evidenciou o papel dos marcadores de CEC na patologia do CMTN. Os nossos achados confirmam a expressão significativa e crescente de CD44 no tecido mamário saudável, nas amostras de CMTN primário e na amostra de metástase cerebral de CMTN. Em relação ao marcador CD133, apesar de não obtermos os resultados esperados nas amostras de tumor primário, conseguimos observar diferenças significativas na expressão deste marcador ao nível das linhas celulares. A expressão aumentada de BCRP/ABCG2 e FZD7 no CMTN, em comparação com o tecido saudável, sublinha o seu envolvimento na resistência a fármacos e na ativação da via Wnt-β-catenina, respetivamente. Estes achados podem ser úteis na compreensão das características das CEC no CMTN e destacam potenciais alvos para intervenção terapêutica. Estudos futuros devem focar-se em aumentar a amostra analisada e em uniformizar as técnicas de preservação de amostras, de modo a validar estes achados e explorar de forma mais eficiente as terapias direcionadas a CEC no CMTN.