Publicação

Tissue tropism and parasite virulence in recently isolated Trypanosoma brucei strains

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Trypanosoma brucei (T. brucei) é um parasita unicelular e extracelular responsável pela doença infeciosa tripanossomíase africana que infeta humanos e mamíferos ungulados. Esta doença, em humanos, é conhecida como tripanossomíase humana ou doença do sono, enquanto que em animais denomina-se de tripanossomíase animal ou nagana. A doença do sono é alvo de eliminação pela Organização Mundial da Saúde até 2030, tendo menos de mil casos sido registados em 2019. Atualmente, a nagana apresenta um elevado impacto económico na casa dos biliões de dólares não só em perdas de produção de gado, mas também da consequente perda em alimentação e agricultura. Na África subsariana, os parasitas são transmitidos ao hospedeiro mamífero através da picada da mosca tsé-tsé (género Glossina) e ao longo do seu ciclo de vida os parasitas apresentam várias formas adaptadas ao ambiente em que se encontram. Existem várias subespécies de T. brucei sendo que apenas as subespécies T. brucei gambiense e T. brucei rhodesiense são patogénicas para humanos, por resistirem à lise por soro humano normal, causando infeções crónicas e agudas, respetivamente. Em investigação biomédica, infeções experimentais são maioritariamente realizadas utilizando parasitas da subespécie T. brucei brucei uma vez que não são infeciosos para humanos. A maioria dos estudos relacionados com a bioquímica e biologia molecular do parasita tripanossoma utilizaram como modelo a estirpe Lister427, uma estirpe considerada monomórfica uma vez que perdeu a capacidade de diferenciação da forma replicativa slender para a forma stumpy, que está sequestrada no ciclo-celular em G1/G0 e adaptada à transmissão de volta ao vetor de transmissão, a mosca tsé-sté. Os nomes fazem referência à morfologia que os parasitas aparentam em cada uma das suas formas, nomeadamente alongada e atarracada, respetivamente. Mais recentemente, estudos relacionados com a capacidade de diferenciação do parasita têm utilizado como modelo a estirpe pleomórfica (possui a capacidade de diferenciação entre as formas slender e stumpy) EATRO1125 (clone AnTat 1.1E 90:13), que está adaptada às condições laboratoriais uma vez que já passou por inúmeras passagens em cultura e em roedores desde que foi clonada em 2004. Dentro do hospedeiro, para além de circularem na corrente sanguínea, os parasitas T. brucei são capazes de colonizar os tecidos sendo que os reservatórios descritos com mais relevância até ao momento são a pele, o sistema nervoso central, o tecido adiposo e o pâncreas. Em 2016, duas novas estirpes de T. brucei brucei, denominadas MAK65 e MAK98, foram isoladas de vacas no Uganda em alturas diferentes do ano, fevereiro e julho respetivamente. Atualmente existe apenas um artigo científico, Mulindwa et al. 2021, que utiliza as estirpes MAK como modelo e as caracteriza. Neste estudo, o laboratório Figueiredo quis aprofundar o conhecimento existente sobre estas duas novas estirpes de parasitas, nomeadamente perceber o quão semelhante era o comportamento das estirpes MAK em relação à estirpe tipicamente usada no laboratório EATRO1125 tanto em cultura (in vitro) como em modelos animais (in vivo). Em cultura, observámos que o tempo que leva para a população de parasitas duplicar foi, para MAK65, aproximadamente duas vez inferior ao calculado para MAK98 (~6h vs ~10h, respetivamente). Para EATRO1125 foi observado um tempo intermédio de duplicação, nomeadamente ~8h30min. Surpreendentemente, ratinhos (C57BL/6J e BALB/cByJ) infetados com ambas as estirpes MAK desenvolveram híper parasitemia (densidades de parasitas no sangue muito elevadas - entre 108-109 parasitas por mililitro de sangue) que resultaram na morte dos ratinhos durante as duas primeiras semanas de infeção. A sobrevivência dos ratinhos infetados com MAK65 foi até 7 dias mais curta do que a dos ratinhos infetados com MAK98, revelando que MAK65 é uma estirpe mais virulenta. Por outro lado, nas infeções com a estirpe EATRO1125 foi observado um característico primeiro pico de parasitemia com um máximo registado abaixo dos 108 parasitas por mililitro de sangue e a infeção desenvolvida foi crónica, os ratinhos sobreviveram, excluindo pontuais exceções, após o dia 30 de infeção. Para testar se os elevados níveis de parasitemia observados eram devidos a uma incapacidade dos parasitas MAK65 e MAK98 de se diferenciarem nas formas não-replicativas stumpy, os níveis de expressão de genes marcadores de formas slender e stumpy foram quantificados em parasitas extraídos aos dias 5/6 após-infeção através da técnica de PCR quantitativo (RT-qPCR). Os parasitas MAK98 apresentam um perfil stumpy semelhante ao observado na estirpe EATRO1125, indicando que a incapacidade de diferenciação dos parasitas não está na origem do desenvolvimento da híper parasitemia. Por outro lado, a estirpe MAK65 apresentou padrão de expressão que não era um clássico perfil de slender nem um de stumpy, indicando que o seu mecanismo de diferenciação pode diferir das estirpes EATRO1125 e MAK98. Um fator importante adicional que controla os níveis de parasitemia é a resposta imunitária. Infeções realizadas em ratinhos Rag2-/- (não possuem nem células T nem B maduras) mostraram, em contraste com o que é observado em infeções por EATRO11255, que o sistema imune adaptativo não teve um impacto considerável na sobrevivência e curva de parasitemia nas infeções com as estirpes MAK. Estes resultados sugerem que estas estirpes conseguem superar o controlo do sistema imune adaptativo e que a causa da morte dos ratinhos infetados com as estirpes MAK provavelmente não é devida a imunopatologia. A severidade global da doença também foi avaliada com o seguimento do peso corporal durante infeção por T. brucei. Em geral podemos afirmar que, independentemente da estirpe de parasita utilizada, os ratinhos C57BL/6J têm uma tendência superior para perder peso do que os ratinhos BALB/cByJ. Para compreender mais extensivamente as variações de peso corporal observadas, foi realizada uma experiência de medição da composição corporal através da técnica de ressonância magnética nuclear. Comparavelmente a EATRO1125, infeções com as estirpes MAK levaram à perda de massa gorda. Adicionalmente, em infeções crónicas com a estirpe EATRO1125 observámos que os ratinhos C57BL/6J tinham tendência para perder massa magra enquanto que os ratinhos BALB/cByJ tinham tendência para ganhar. Os baços destes últimos animais aumentaram cerca de 10 vezes em relação aos controlos não infetados, podendo ser uma explicação para o aumento da massa magra verificado. Foi-nos possível isolar parasitas do tecido adiposo gonadal de ambas as estirpes MAK o que possibilita futuros estudos nestas formas dos parasitas, que na estirpe EATRO1125 estão reportados como sendo parasitas de crescimento lento com um transcriptoma diferente dos parasitas do sangue. Por último, o tropismo nos tecidos foi avaliado através da quantificação da quantidade de parasitas nos órgãos principais através da técnica PCR quantitativo (qPCR). MAK98 acumula-se preferencialmente no pâncreas e no tecido adiposo, órgãos anteriormente reportados como sendo reservatórios extravasculares em infeções com EATRO1125. MAK65 também se acumulou no tecido adiposo, no entanto o pâncreas foi o órgão menos colonizado nesta estirpe. De salientar que ambas as estirpes MAK acumularam em maiores quantidades em órgãos vitais, como os rins e o cérebro, que a estirpe EATRO1125, sugerindo que a colonização destes órgãos pode estar relacionada com a sua virulência exacerbada. Em conclusão, o nosso estudo sublinha a importância de utilizar múltiplas estirpes quando analisamos fenótipos de infeção uma vez que a patologia pode ser dependente da estirpe de parasita usada. Adicionalmente, este trabalho propõe que MAK65 ou MAK98 possam ser um bom modelo para estudar doença aguda, não só pelo seu fenótipo, mas também por terem mostrado ser fáceis de manter em ambiente laboratorial. Apesar de EATRO1125 continuar a ser um bom modelo para estudar tripanossomíase africana crónica, novos modelos devem ser introduzidos para criar a diversidade necessária para procurar variabilidade fenotípica.
Autores principais:	Narciso, Marta Valido
Assunto:	Trypanosoma brucei Doença do sono Tropismo dos tecidos MAK65 MAK98 Teses de mestrado - 2023
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Trypanosoma brucei (T. brucei) é um parasita unicelular e extracelular responsável pela doença infeciosa tripanossomíase africana que infeta humanos e mamíferos ungulados. Esta doença, em humanos, é conhecida como tripanossomíase humana ou doença do sono, enquanto que em animais denomina-se de tripanossomíase animal ou nagana. A doença do sono é alvo de eliminação pela Organização Mundial da Saúde até 2030, tendo menos de mil casos sido registados em 2019. Atualmente, a nagana apresenta um elevado impacto económico na casa dos biliões de dólares não só em perdas de produção de gado, mas também da consequente perda em alimentação e agricultura. Na África subsariana, os parasitas são transmitidos ao hospedeiro mamífero através da picada da mosca tsé-tsé (género Glossina) e ao longo do seu ciclo de vida os parasitas apresentam várias formas adaptadas ao ambiente em que se encontram. Existem várias subespécies de T. brucei sendo que apenas as subespécies T. brucei gambiense e T. brucei rhodesiense são patogénicas para humanos, por resistirem à lise por soro humano normal, causando infeções crónicas e agudas, respetivamente. Em investigação biomédica, infeções experimentais são maioritariamente realizadas utilizando parasitas da subespécie T. brucei brucei uma vez que não são infeciosos para humanos. A maioria dos estudos relacionados com a bioquímica e biologia molecular do parasita tripanossoma utilizaram como modelo a estirpe Lister427, uma estirpe considerada monomórfica uma vez que perdeu a capacidade de diferenciação da forma replicativa slender para a forma stumpy, que está sequestrada no ciclo-celular em G1/G0 e adaptada à transmissão de volta ao vetor de transmissão, a mosca tsé-sté. Os nomes fazem referência à morfologia que os parasitas aparentam em cada uma das suas formas, nomeadamente alongada e atarracada, respetivamente. Mais recentemente, estudos relacionados com a capacidade de diferenciação do parasita têm utilizado como modelo a estirpe pleomórfica (possui a capacidade de diferenciação entre as formas slender e stumpy) EATRO1125 (clone AnTat 1.1E 90:13), que está adaptada às condições laboratoriais uma vez que já passou por inúmeras passagens em cultura e em roedores desde que foi clonada em 2004. Dentro do hospedeiro, para além de circularem na corrente sanguínea, os parasitas T. brucei são capazes de colonizar os tecidos sendo que os reservatórios descritos com mais relevância até ao momento são a pele, o sistema nervoso central, o tecido adiposo e o pâncreas. Em 2016, duas novas estirpes de T. brucei brucei, denominadas MAK65 e MAK98, foram isoladas de vacas no Uganda em alturas diferentes do ano, fevereiro e julho respetivamente. Atualmente existe apenas um artigo científico, Mulindwa et al. 2021, que utiliza as estirpes MAK como modelo e as caracteriza. Neste estudo, o laboratório Figueiredo quis aprofundar o conhecimento existente sobre estas duas novas estirpes de parasitas, nomeadamente perceber o quão semelhante era o comportamento das estirpes MAK em relação à estirpe tipicamente usada no laboratório EATRO1125 tanto em cultura (in vitro) como em modelos animais (in vivo). Em cultura, observámos que o tempo que leva para a população de parasitas duplicar foi, para MAK65, aproximadamente duas vez inferior ao calculado para MAK98 (~6h vs ~10h, respetivamente). Para EATRO1125 foi observado um tempo intermédio de duplicação, nomeadamente ~8h30min. Surpreendentemente, ratinhos (C57BL/6J e BALB/cByJ) infetados com ambas as estirpes MAK desenvolveram híper parasitemia (densidades de parasitas no sangue muito elevadas - entre 108-109 parasitas por mililitro de sangue) que resultaram na morte dos ratinhos durante as duas primeiras semanas de infeção. A sobrevivência dos ratinhos infetados com MAK65 foi até 7 dias mais curta do que a dos ratinhos infetados com MAK98, revelando que MAK65 é uma estirpe mais virulenta. Por outro lado, nas infeções com a estirpe EATRO1125 foi observado um característico primeiro pico de parasitemia com um máximo registado abaixo dos 108 parasitas por mililitro de sangue e a infeção desenvolvida foi crónica, os ratinhos sobreviveram, excluindo pontuais exceções, após o dia 30 de infeção. Para testar se os elevados níveis de parasitemia observados eram devidos a uma incapacidade dos parasitas MAK65 e MAK98 de se diferenciarem nas formas não-replicativas stumpy, os níveis de expressão de genes marcadores de formas slender e stumpy foram quantificados em parasitas extraídos aos dias 5/6 após-infeção através da técnica de PCR quantitativo (RT-qPCR). Os parasitas MAK98 apresentam um perfil stumpy semelhante ao observado na estirpe EATRO1125, indicando que a incapacidade de diferenciação dos parasitas não está na origem do desenvolvimento da híper parasitemia. Por outro lado, a estirpe MAK65 apresentou padrão de expressão que não era um clássico perfil de slender nem um de stumpy, indicando que o seu mecanismo de diferenciação pode diferir das estirpes EATRO1125 e MAK98. Um fator importante adicional que controla os níveis de parasitemia é a resposta imunitária. Infeções realizadas em ratinhos Rag2-/- (não possuem nem células T nem B maduras) mostraram, em contraste com o que é observado em infeções por EATRO11255, que o sistema imune adaptativo não teve um impacto considerável na sobrevivência e curva de parasitemia nas infeções com as estirpes MAK. Estes resultados sugerem que estas estirpes conseguem superar o controlo do sistema imune adaptativo e que a causa da morte dos ratinhos infetados com as estirpes MAK provavelmente não é devida a imunopatologia. A severidade global da doença também foi avaliada com o seguimento do peso corporal durante infeção por T. brucei. Em geral podemos afirmar que, independentemente da estirpe de parasita utilizada, os ratinhos C57BL/6J têm uma tendência superior para perder peso do que os ratinhos BALB/cByJ. Para compreender mais extensivamente as variações de peso corporal observadas, foi realizada uma experiência de medição da composição corporal através da técnica de ressonância magnética nuclear. Comparavelmente a EATRO1125, infeções com as estirpes MAK levaram à perda de massa gorda. Adicionalmente, em infeções crónicas com a estirpe EATRO1125 observámos que os ratinhos C57BL/6J tinham tendência para perder massa magra enquanto que os ratinhos BALB/cByJ tinham tendência para ganhar. Os baços destes últimos animais aumentaram cerca de 10 vezes em relação aos controlos não infetados, podendo ser uma explicação para o aumento da massa magra verificado. Foi-nos possível isolar parasitas do tecido adiposo gonadal de ambas as estirpes MAK o que possibilita futuros estudos nestas formas dos parasitas, que na estirpe EATRO1125 estão reportados como sendo parasitas de crescimento lento com um transcriptoma diferente dos parasitas do sangue. Por último, o tropismo nos tecidos foi avaliado através da quantificação da quantidade de parasitas nos órgãos principais através da técnica PCR quantitativo (qPCR). MAK98 acumula-se preferencialmente no pâncreas e no tecido adiposo, órgãos anteriormente reportados como sendo reservatórios extravasculares em infeções com EATRO1125. MAK65 também se acumulou no tecido adiposo, no entanto o pâncreas foi o órgão menos colonizado nesta estirpe. De salientar que ambas as estirpes MAK acumularam em maiores quantidades em órgãos vitais, como os rins e o cérebro, que a estirpe EATRO1125, sugerindo que a colonização destes órgãos pode estar relacionada com a sua virulência exacerbada. Em conclusão, o nosso estudo sublinha a importância de utilizar múltiplas estirpes quando analisamos fenótipos de infeção uma vez que a patologia pode ser dependente da estirpe de parasita usada. Adicionalmente, este trabalho propõe que MAK65 ou MAK98 possam ser um bom modelo para estudar doença aguda, não só pelo seu fenótipo, mas também por terem mostrado ser fáceis de manter em ambiente laboratorial. Apesar de EATRO1125 continuar a ser um bom modelo para estudar tripanossomíase africana crónica, novos modelos devem ser introduzidos para criar a diversidade necessária para procurar variabilidade fenotípica.