Publicação

In vivo investigation of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus LANA and its WIN-like motif in latency using chimeric MHV-68 viruses

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Os herpesvírus (HVs) são vírus muito prevalentes que estabelecem infeções crónicas (que duram toda a vida) e para os quais não existe cura. O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um vírus oncogénico responsável por provocar doença sintomática maioritariamente em indivíduos imunodeprimidos, tais como pacientes infetados com VIH. O genoma do KSHV é constituído por uma cadeia dupla de DNA que inclui uma região única central, com um tamanho aproximado de 140 kpb, que contém as regiões codificantes e que é flanqueada por repetições terminais (TRs). Como todos os herpesvírus, o KSHV tem um ciclo de vida bifásico, constituído por uma fase lítica e uma fase latente. A fase lítica é caracterizada pela expressão de grande parte dos genes virais e pela produção de novos viriões que, consequentemente, levam à lise celular. A fase latente é a via padrão de infeção do KSHV, na qual o genoma viral é mantido, essencialmente, no núcleo das células B do hospedeiro como uma forma circular extra- cromossómica denominada epissoma. Durante a latência, há uma forte repressão da expressão genética e não há produção de partículas virais, o que permite ao vírus escapar à resposta imunológica do hospedeiro. O balanço entre as fases lítica e latente é essencial para a manutenção e sobrevivência do vírus. O antigénio nuclear associado à latência (LANA) é altamente expresso em células infetadas de forma latente. Esta proteína multifuncional, com 1162 aminoácidos, é responsável pela persistência e pela segregação do epissoma viral nas células, o qual é replicado juntamente com o genoma celular. Para exercer a sua função, a LANA liga-se aos TRs do genoma viral através da sua região C-terminal e a histonas do DNA celular através da sua região N-terminal. A LANA também é capaz de regular a expressão dos genes virais afetando as modificações da cromatina viral, através da interação com complexos de modificação de histonas. Uma das mais importantes modificações de histonas virais é a tri-metilação do 4º resíduo de lisina da histona H3 (H3K4me3), presente em TRs do DNA viral e envolvida na ativação de genes da fase latente. Recentemente, foi descrito que a LANA inibe a atividade do complexo de metilação MLL1, responsável pela deposição de H3K4me3 em TRs. A atividade deste complexo depende do WDR5, que se liga normalmente à MLL1 através de um motivo de interação com WDR5 (WIN). A LANA também tem um motivo WIN capaz de se ligar ao WDR5, competindo com a MLL1 e regulando a deposição deH3K4me3. Além disso, descobriu-se que a DNase1L3 celular degrada o DNA do KSHV após a infeção e que os níveis de DNA viral correlacionam-se negativamente com os níveis de H3K4me3 nos TRs. Consequentemente, esse padrão de metilação foi visto recentemente como um novo mecanismo de defesa antiviral do hospedeiro. Uma das limitações para o estudo in vivo do KSHV é a falta de um modelo animal de infeção, uma vez que este vírus só infeta humanos. O herpesvírus de murganho 68 (MHV-68) está geneticamente relacionado com o KSHV e consegue estabelecer uma infeção latente em murganhos, representando por isso um bom sistema modelo a usar. Após a inoculação intranasal do vírus em murganhos, ocorre uma fase de replicação lítica nas células epiteliais pulmonares. De seguida, o vírus dissemina-se para o baço onde infeta as células B do centro germinativo. Aí, ocorre a proliferação de células B infetadas, sucedendo-se o estabelecimento de latência nas células B de memória. Estas constituem o reservatório viral a longo prazo. O MHV-68 também expressa uma proteína LANA (mLANA) funcionalmente homóloga à LANA do KSHV (kLANA). Assim, foi criado um vírus MHV-68 quimera, no qual a mLANA foi substituída pela kLANA, no genoma do MHV-68, permitindo o estudo das funções da kLANA durante a infeção in vivo. O objetivo deste estudo foi analisar a relevância do motivo WIN da kLANA, avaliando a sua capacidade de inibir a atividade da MLL1, através do uso do vírus MHV- 68 quimera em infeções in vivo. Duas mutações no motivo WIN da kLANA foram previamente criadas – uma para aumentar (AARA) e outra para enfraquecer (PAA) a afinidade da kLANA pelo WDR5. Os efeitos destas mutações no estabelecimento de latência in vivo foram estudados. O gene mutado que codifica para a kLANA foi clonado num cromossoma artificial bacteriano (BAC) que contém o genoma do MHV-68, substituindo o gene que codifica a mLANA, através de recombinação homóloga. Os BACs mutantes AARA e PAA foram construídos de modo a expressarem a yellow fluorescent protein (YFP), o que permite rastrear a infeção através de análises por citometria de fluxo. Após a obtenção de vários clones, estes foram selecionados de acordo com a presença correta da kLANA nos BACs recombinantes através de PCR e dos perfis de digestão do genoma de MHV-68 com as enzimas de restrição EcoRI, BamHI, HindIII e ApaI. Depois da produção de stocks virais dos vírus mutantes, a partir dos BACs, foram realizados ensaios in vitro para analisar a cinética de crescimento dos vírus e para confirmar a expressão de proteínas. Para analisar a cinética de crescimento, células permissivas foram infetadas com os vírus mutantes, v-AARA.yfp e v-PAA.yfp, e com os vírus controlo, v-WT.yfp e v-kLANA.yfp. As células infetadas foram recolhidas em seis tempos específicos: 0, 24, 48, 72, 96 e 120 horas pós-infeção. Depois de terem sido congeladas, as amostras foram tituladas. Os títulos virais obtidos permitiram traçar uma curva de crescimento para cada vírus. Verificou-se que os vírus quimera apresentaram um crescimento in vitro semelhante ao do vírus MHV-68 wild-type (WT). Além desta experiência, também foi realizado um Western blot para a deteção das proteínas kLANA, YFP, mLANA, M3 (proteína viral que se liga a quimiocinas) e da proteína celular actina. Confirmou-se que as mutações introduzidas no motivo WIN da kLANA não afetaram a expressão normal da kLANA. Contudo, nem todos os vírus expressaram YFP, pelo que os que estavam nesta condição foram excluídos dos ensaios futuros. De seguida, sucederam-se os ensaios animais para o estudo do estabelecimento de latência in vivo, sendo que 3 grupos de 5 murganhos da estirpe BALB/cByJ foram inicialmente infetados com os vírus quimera (v-kLANA.yfp) e com o vírus MHV.68 WT (v-WT.yfp). Este primeiro conjunto de infeções permitiu verificar a consistência dos resultados obtidos com o que já tinha sido descrito e serviram como controlos standard para as experiências seguintes realizadas com os vírus mutantes. Para analisar a relevância das mutações, 3 grupos de 5 murganhos foram infetados com os vírus mutantes (v- AARA.yfp e v-PAA.yfp) e com o vírus quimera (v-kLANA.yfp), enquanto controlo desta experiência. Ao 14º dia após a inoculação intranasal (pico de latência), os murganhos foram sacrificados e os baços foram removidos e devidamente processados para os ensaios subsequentes. Para avaliar os níveis de latência, foi realizado um ensaio de reativação ex vivo, baseando-se na cultura simultânea de células permissivas e células do baço de murganhos infetados. Além disto, também foi determinada a frequência de células positivas para a presença de DNA viral, através do ensaio de diluição limitante e PCR em tempo real. Concomitantemente, a frequência de células do baço infetadas também foi avaliada por citometria de fluxo. Ao 14º dia pós-infeção, todos os vírus apresentaram níveis semelhantes, quer de latência, quer de células positivas para o DNA viral. No entanto, ao 21º dia pós-infeção verificou-se que o vírus mutante v-PAA.yfp apresentou níveis significativamente mais baixos de latência em comparação com o vírus quimera controlo. A frequência de células positivas para o DNA viral também foi significativamente mais baixa para o v-PAA.yfp em relação ao controlo. Deste modo, os resultados in vivo demonstraram que enfraquecer a interação entre kLANA e WDR5 não afetou a expansão das células B do centro germinativo no baço, que constituem o principal alvo do MHV-68 para o estabelecimento de latência. No entanto, levou à redução dos níveis de latência aos 21 dias pós-infeção, possivelmente afetando a persistência do epissoma a longo prazo e corroborando o mecanismo supramencionado. Aumentar a afinidade da kLANA para o WDR5 não teve um efeito marcante nos níveis gerais de latência. Estudos complementares devem ser realizados para esclarecer estes resultados e a importância da MLL1 e a sua interação com a kLANA e o WDR5, a tri-metilação de histonas virais e a degradação do DNA viral.
Autores principais:	Andersen, Francisca Bixirão Ferreira
Assunto:	Herpes vírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) Antigénio nuclear associado à latência (LANA) Herpesvírus de murganho 68 (MHV-68) MLL1 Latência Teses de mestrado - 2022
Ano:	2022
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Os herpesvírus (HVs) são vírus muito prevalentes que estabelecem infeções crónicas (que duram toda a vida) e para os quais não existe cura. O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um vírus oncogénico responsável por provocar doença sintomática maioritariamente em indivíduos imunodeprimidos, tais como pacientes infetados com VIH. O genoma do KSHV é constituído por uma cadeia dupla de DNA que inclui uma região única central, com um tamanho aproximado de 140 kpb, que contém as regiões codificantes e que é flanqueada por repetições terminais (TRs). Como todos os herpesvírus, o KSHV tem um ciclo de vida bifásico, constituído por uma fase lítica e uma fase latente. A fase lítica é caracterizada pela expressão de grande parte dos genes virais e pela produção de novos viriões que, consequentemente, levam à lise celular. A fase latente é a via padrão de infeção do KSHV, na qual o genoma viral é mantido, essencialmente, no núcleo das células B do hospedeiro como uma forma circular extra- cromossómica denominada epissoma. Durante a latência, há uma forte repressão da expressão genética e não há produção de partículas virais, o que permite ao vírus escapar à resposta imunológica do hospedeiro. O balanço entre as fases lítica e latente é essencial para a manutenção e sobrevivência do vírus. O antigénio nuclear associado à latência (LANA) é altamente expresso em células infetadas de forma latente. Esta proteína multifuncional, com 1162 aminoácidos, é responsável pela persistência e pela segregação do epissoma viral nas células, o qual é replicado juntamente com o genoma celular. Para exercer a sua função, a LANA liga-se aos TRs do genoma viral através da sua região C-terminal e a histonas do DNA celular através da sua região N-terminal. A LANA também é capaz de regular a expressão dos genes virais afetando as modificações da cromatina viral, através da interação com complexos de modificação de histonas. Uma das mais importantes modificações de histonas virais é a tri-metilação do 4º resíduo de lisina da histona H3 (H3K4me3), presente em TRs do DNA viral e envolvida na ativação de genes da fase latente. Recentemente, foi descrito que a LANA inibe a atividade do complexo de metilação MLL1, responsável pela deposição de H3K4me3 em TRs. A atividade deste complexo depende do WDR5, que se liga normalmente à MLL1 através de um motivo de interação com WDR5 (WIN). A LANA também tem um motivo WIN capaz de se ligar ao WDR5, competindo com a MLL1 e regulando a deposição deH3K4me3. Além disso, descobriu-se que a DNase1L3 celular degrada o DNA do KSHV após a infeção e que os níveis de DNA viral correlacionam-se negativamente com os níveis de H3K4me3 nos TRs. Consequentemente, esse padrão de metilação foi visto recentemente como um novo mecanismo de defesa antiviral do hospedeiro. Uma das limitações para o estudo in vivo do KSHV é a falta de um modelo animal de infeção, uma vez que este vírus só infeta humanos. O herpesvírus de murganho 68 (MHV-68) está geneticamente relacionado com o KSHV e consegue estabelecer uma infeção latente em murganhos, representando por isso um bom sistema modelo a usar. Após a inoculação intranasal do vírus em murganhos, ocorre uma fase de replicação lítica nas células epiteliais pulmonares. De seguida, o vírus dissemina-se para o baço onde infeta as células B do centro germinativo. Aí, ocorre a proliferação de células B infetadas, sucedendo-se o estabelecimento de latência nas células B de memória. Estas constituem o reservatório viral a longo prazo. O MHV-68 também expressa uma proteína LANA (mLANA) funcionalmente homóloga à LANA do KSHV (kLANA). Assim, foi criado um vírus MHV-68 quimera, no qual a mLANA foi substituída pela kLANA, no genoma do MHV-68, permitindo o estudo das funções da kLANA durante a infeção in vivo. O objetivo deste estudo foi analisar a relevância do motivo WIN da kLANA, avaliando a sua capacidade de inibir a atividade da MLL1, através do uso do vírus MHV- 68 quimera em infeções in vivo. Duas mutações no motivo WIN da kLANA foram previamente criadas – uma para aumentar (AARA) e outra para enfraquecer (PAA) a afinidade da kLANA pelo WDR5. Os efeitos destas mutações no estabelecimento de latência in vivo foram estudados. O gene mutado que codifica para a kLANA foi clonado num cromossoma artificial bacteriano (BAC) que contém o genoma do MHV-68, substituindo o gene que codifica a mLANA, através de recombinação homóloga. Os BACs mutantes AARA e PAA foram construídos de modo a expressarem a yellow fluorescent protein (YFP), o que permite rastrear a infeção através de análises por citometria de fluxo. Após a obtenção de vários clones, estes foram selecionados de acordo com a presença correta da kLANA nos BACs recombinantes através de PCR e dos perfis de digestão do genoma de MHV-68 com as enzimas de restrição EcoRI, BamHI, HindIII e ApaI. Depois da produção de stocks virais dos vírus mutantes, a partir dos BACs, foram realizados ensaios in vitro para analisar a cinética de crescimento dos vírus e para confirmar a expressão de proteínas. Para analisar a cinética de crescimento, células permissivas foram infetadas com os vírus mutantes, v-AARA.yfp e v-PAA.yfp, e com os vírus controlo, v-WT.yfp e v-kLANA.yfp. As células infetadas foram recolhidas em seis tempos específicos: 0, 24, 48, 72, 96 e 120 horas pós-infeção. Depois de terem sido congeladas, as amostras foram tituladas. Os títulos virais obtidos permitiram traçar uma curva de crescimento para cada vírus. Verificou-se que os vírus quimera apresentaram um crescimento in vitro semelhante ao do vírus MHV-68 wild-type (WT). Além desta experiência, também foi realizado um Western blot para a deteção das proteínas kLANA, YFP, mLANA, M3 (proteína viral que se liga a quimiocinas) e da proteína celular actina. Confirmou-se que as mutações introduzidas no motivo WIN da kLANA não afetaram a expressão normal da kLANA. Contudo, nem todos os vírus expressaram YFP, pelo que os que estavam nesta condição foram excluídos dos ensaios futuros. De seguida, sucederam-se os ensaios animais para o estudo do estabelecimento de latência in vivo, sendo que 3 grupos de 5 murganhos da estirpe BALB/cByJ foram inicialmente infetados com os vírus quimera (v-kLANA.yfp) e com o vírus MHV.68 WT (v-WT.yfp). Este primeiro conjunto de infeções permitiu verificar a consistência dos resultados obtidos com o que já tinha sido descrito e serviram como controlos standard para as experiências seguintes realizadas com os vírus mutantes. Para analisar a relevância das mutações, 3 grupos de 5 murganhos foram infetados com os vírus mutantes (v- AARA.yfp e v-PAA.yfp) e com o vírus quimera (v-kLANA.yfp), enquanto controlo desta experiência. Ao 14º dia após a inoculação intranasal (pico de latência), os murganhos foram sacrificados e os baços foram removidos e devidamente processados para os ensaios subsequentes. Para avaliar os níveis de latência, foi realizado um ensaio de reativação ex vivo, baseando-se na cultura simultânea de células permissivas e células do baço de murganhos infetados. Além disto, também foi determinada a frequência de células positivas para a presença de DNA viral, através do ensaio de diluição limitante e PCR em tempo real. Concomitantemente, a frequência de células do baço infetadas também foi avaliada por citometria de fluxo. Ao 14º dia pós-infeção, todos os vírus apresentaram níveis semelhantes, quer de latência, quer de células positivas para o DNA viral. No entanto, ao 21º dia pós-infeção verificou-se que o vírus mutante v-PAA.yfp apresentou níveis significativamente mais baixos de latência em comparação com o vírus quimera controlo. A frequência de células positivas para o DNA viral também foi significativamente mais baixa para o v-PAA.yfp em relação ao controlo. Deste modo, os resultados in vivo demonstraram que enfraquecer a interação entre kLANA e WDR5 não afetou a expansão das células B do centro germinativo no baço, que constituem o principal alvo do MHV-68 para o estabelecimento de latência. No entanto, levou à redução dos níveis de latência aos 21 dias pós-infeção, possivelmente afetando a persistência do epissoma a longo prazo e corroborando o mecanismo supramencionado. Aumentar a afinidade da kLANA para o WDR5 não teve um efeito marcante nos níveis gerais de latência. Estudos complementares devem ser realizados para esclarecer estes resultados e a importância da MLL1 e a sua interação com a kLANA e o WDR5, a tri-metilação de histonas virais e a degradação do DNA viral.