Publicação
Egfr and pi3k inhibitors as new therapeutics against brain metastasis of breast cancer cells
| Resumo: | O cancro da mama triplo-negativo (TNBC) é amplamente reconhecido como um dos subtipos de cancro da mama (BC) mais devastadores. A falta de diagnóstico apropriado, aliada à natureza agressiva deste tipo de cancro, costuma culminar com o aparecimento de metástases encefálicas. Embora já existam muitos tratamentos para o BC em estágio inicial, o TNBC apresenta menos opções terapêuticas devido à falta de alvos moleculares bem definidos, resultando num mau prognóstico e numa alta taxa de mortalidade. Isto é particularmente relevante quando o TNBC metastiza para o encéfalo, onde a distribuição de fármacos é limitada por uma barreira de permeabilidade restrita – a barreira hematoencefálica (BBB). No entanto, o TNBC tem vindo a ser associado a uma sobreexpressão do recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) que regula diversas vias importantes para a formação das metástases, sendo um potencial alvo terapêutico a ser explorado. Assim, é necessário realizar estudos adicionais para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de metástases encefálicas de BC (BCBM), baseadas na utilização de inibidores de EGFR e/ou PI3K com capacidade de atravessar a BBB, com o objetivo de determinar o seu efeito nos processos de desenvolvimento das células tumorais tais como viabilidade, migração, alterações do ciclo celular e morte celular programada, examinando seu potencial nos alvos moleculares chave da via de sinalização a jusante do EGFR. Para preencher as lacunas no conhecimento atual, delineámos os seguintes objetivos para esta tese: rastrear os efeitos citotóxicos dos inibidores do EGFR, PI3K e duplos (EGFR/PI3K) em células de BC e determinar a concentração que produz metade do efeito inibitório máximo (IC50); determinar a eficácia dos inibidores na migração, alterações do ciclo celular e morte celular programada de modo a identificar os mais promissores, e avaliar o potencial das moléculas candidatas em alvos moleculares chave da via de sinalização a jusante do EGFR com relevância para a erradicação de BCBM. Foi utilizada a linha de células de adenocarcinoma humano (MDA-MB-231 Br4 marcada com GFP), uma linha de TNBC com propensão para formação de metástase no encéfalo. Usámos uma biblioteca de 27 pequenas moléculas, composta por inibidores do EGFR, PI3K e duplos (EGFR/PI3K), capazes de atravessar a BBB, identificadas com base em estudos in silico anteriormente realizados no nosso laboratório. A fim de avaliar a citotoxicidade de cada molécula, foi avaliada a viabilidade das células MDA-MB-231 Br4. Foram utilizados os seguintes critérios para a seleção das moléculas mais promissoras: inclusão de pequenas moléculas de cada um dos grupos; inclusão de moléculas que induziram perda de viabilidade celular superior a 50%; e inclusão de moléculas que promovam uma diminuição da viabilidade dependente da dose e com efeitos significativos a partir da concentração de 1 µM. Com base nesta análise foram selecionados três inibidores de EGFR (molécula 10, 13 e 14), dois inibidores de PI3Kp110β (molécula 22 e 23) e dois inibidores duplos (molécula 25 e 27). Foi determinado o seu IC50, tendo-se verificado que cinco destas moléculas (molécula 10, 13, 23, 25 e 27) apresentaram valores abaixo de 100 μM, sendo as mais auspiciosas para prosseguir nos estudos seguintes. As células MDA-MB-231 Br4 foram tratadas com cada uma das cinco moléculas selecionadas na sua concentração de IC50e procedeu-se à análise da morfologia nuclear. Os resultados mostraram que, ao fim de 24 h, todos os inibidores promoviam uma diminuição do número de células e um aumento de células não viáveis, revelado através do aumento de núcleos picnóticos e apoptóticos, principalmente na presença das moléculas 23, 25 e 27. Em paralelo, foi avaliado o efeito na capacidade de migração de células tumorais, usando um ensaio de raspagem, verificando-se que os inibidores duplos (moléculas 25 e 27) apresentaram o efeito mais notório, reforçando o seu potencial. Além disso, os inibidores duplos parecem desempenhar um papel importante na modulação da expressão da proteína associada à progressão do ciclo celular (ciclina D2), indicado pelo aumento da expressão desta proteína, apontando para a promoção da morte celular pelas moléculas. A análise imunocitoquímica também demonstrou que a proteína associada à proliferação, Ki-67, sofreu alterações na presença de cada inibidor, notório logo 6 horas após o tratamento, sendo mais percetível para a molécula 27. Já a molécula 25 possui um forte efeito contra as células TNBC, uma vez que quase todas as células estão danificadas ao fim de 24 h. Em termos de morfologia das células tumorais, ambas as moléculas começam a ter efeito ao fim de 3 h, sendo claramente visível a alteração no sinal de GFP e a condensação da cromatina nuclear após 6 h, evidenciando-se também uma diminuição significativa no número de células tumorais e uma diminuição na área e perímetro celular e nuclear, nas células que sobreviveram, sendo este efeito mais marcado com a molécula 25. Em relação à modulação da via de sinalização, a destruição precoce e massiva das células induzida pela molécula 25 dificultou a interpretação das alterações nas proteínas estudadas, designadamente o EGFR, a fosfoproteína cinase B (p-AKT), a metaloproteinase da matriz 9 (MMP9) e o fator intensificador de miócitos 2C (MEF2C), não obstante ser evidente a diminuição da proteína forkhead box P1 (FOXP1), um fator de transcrição associado à migração celular. Por outro lado, a molécula 27 apresentou uma clara redução na ativação de AKT, consequentemente reduzindo a expressão dos intervenientes a jusante, como a MMP9 e o MEF2C. No geral, estes resultados revelaram que os inibidores duplos do EGFR e do PI3Kp110β são mais eficazes do que os inibidores simples, o que indica a relevância de terapêuticas multi-alvo. De realçar que tais inibidores duplos podem modular a via EGFR/PI3K, controlando a morte das células tumorais, a migração e o ciclo celular, afetando especificamente alvos a jusante. Assim, coletivamente, os achados obtidos abrem portas para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para combater o BCBM. |
|---|---|
| Autores principais: | Mendes, Avilson Hiraldo Spencer Veiga |
| Assunto: | Breast cancer brain metastases EGFR Migration PI3K Proliferation Teses de mestrado - 2021 |
| Ano: | 2021 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso restrito |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | O cancro da mama triplo-negativo (TNBC) é amplamente reconhecido como um dos subtipos de cancro da mama (BC) mais devastadores. A falta de diagnóstico apropriado, aliada à natureza agressiva deste tipo de cancro, costuma culminar com o aparecimento de metástases encefálicas. Embora já existam muitos tratamentos para o BC em estágio inicial, o TNBC apresenta menos opções terapêuticas devido à falta de alvos moleculares bem definidos, resultando num mau prognóstico e numa alta taxa de mortalidade. Isto é particularmente relevante quando o TNBC metastiza para o encéfalo, onde a distribuição de fármacos é limitada por uma barreira de permeabilidade restrita – a barreira hematoencefálica (BBB). No entanto, o TNBC tem vindo a ser associado a uma sobreexpressão do recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) que regula diversas vias importantes para a formação das metástases, sendo um potencial alvo terapêutico a ser explorado. Assim, é necessário realizar estudos adicionais para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de metástases encefálicas de BC (BCBM), baseadas na utilização de inibidores de EGFR e/ou PI3K com capacidade de atravessar a BBB, com o objetivo de determinar o seu efeito nos processos de desenvolvimento das células tumorais tais como viabilidade, migração, alterações do ciclo celular e morte celular programada, examinando seu potencial nos alvos moleculares chave da via de sinalização a jusante do EGFR. Para preencher as lacunas no conhecimento atual, delineámos os seguintes objetivos para esta tese: rastrear os efeitos citotóxicos dos inibidores do EGFR, PI3K e duplos (EGFR/PI3K) em células de BC e determinar a concentração que produz metade do efeito inibitório máximo (IC50); determinar a eficácia dos inibidores na migração, alterações do ciclo celular e morte celular programada de modo a identificar os mais promissores, e avaliar o potencial das moléculas candidatas em alvos moleculares chave da via de sinalização a jusante do EGFR com relevância para a erradicação de BCBM. Foi utilizada a linha de células de adenocarcinoma humano (MDA-MB-231 Br4 marcada com GFP), uma linha de TNBC com propensão para formação de metástase no encéfalo. Usámos uma biblioteca de 27 pequenas moléculas, composta por inibidores do EGFR, PI3K e duplos (EGFR/PI3K), capazes de atravessar a BBB, identificadas com base em estudos in silico anteriormente realizados no nosso laboratório. A fim de avaliar a citotoxicidade de cada molécula, foi avaliada a viabilidade das células MDA-MB-231 Br4. Foram utilizados os seguintes critérios para a seleção das moléculas mais promissoras: inclusão de pequenas moléculas de cada um dos grupos; inclusão de moléculas que induziram perda de viabilidade celular superior a 50%; e inclusão de moléculas que promovam uma diminuição da viabilidade dependente da dose e com efeitos significativos a partir da concentração de 1 µM. Com base nesta análise foram selecionados três inibidores de EGFR (molécula 10, 13 e 14), dois inibidores de PI3Kp110β (molécula 22 e 23) e dois inibidores duplos (molécula 25 e 27). Foi determinado o seu IC50, tendo-se verificado que cinco destas moléculas (molécula 10, 13, 23, 25 e 27) apresentaram valores abaixo de 100 μM, sendo as mais auspiciosas para prosseguir nos estudos seguintes. As células MDA-MB-231 Br4 foram tratadas com cada uma das cinco moléculas selecionadas na sua concentração de IC50e procedeu-se à análise da morfologia nuclear. Os resultados mostraram que, ao fim de 24 h, todos os inibidores promoviam uma diminuição do número de células e um aumento de células não viáveis, revelado através do aumento de núcleos picnóticos e apoptóticos, principalmente na presença das moléculas 23, 25 e 27. Em paralelo, foi avaliado o efeito na capacidade de migração de células tumorais, usando um ensaio de raspagem, verificando-se que os inibidores duplos (moléculas 25 e 27) apresentaram o efeito mais notório, reforçando o seu potencial. Além disso, os inibidores duplos parecem desempenhar um papel importante na modulação da expressão da proteína associada à progressão do ciclo celular (ciclina D2), indicado pelo aumento da expressão desta proteína, apontando para a promoção da morte celular pelas moléculas. A análise imunocitoquímica também demonstrou que a proteína associada à proliferação, Ki-67, sofreu alterações na presença de cada inibidor, notório logo 6 horas após o tratamento, sendo mais percetível para a molécula 27. Já a molécula 25 possui um forte efeito contra as células TNBC, uma vez que quase todas as células estão danificadas ao fim de 24 h. Em termos de morfologia das células tumorais, ambas as moléculas começam a ter efeito ao fim de 3 h, sendo claramente visível a alteração no sinal de GFP e a condensação da cromatina nuclear após 6 h, evidenciando-se também uma diminuição significativa no número de células tumorais e uma diminuição na área e perímetro celular e nuclear, nas células que sobreviveram, sendo este efeito mais marcado com a molécula 25. Em relação à modulação da via de sinalização, a destruição precoce e massiva das células induzida pela molécula 25 dificultou a interpretação das alterações nas proteínas estudadas, designadamente o EGFR, a fosfoproteína cinase B (p-AKT), a metaloproteinase da matriz 9 (MMP9) e o fator intensificador de miócitos 2C (MEF2C), não obstante ser evidente a diminuição da proteína forkhead box P1 (FOXP1), um fator de transcrição associado à migração celular. Por outro lado, a molécula 27 apresentou uma clara redução na ativação de AKT, consequentemente reduzindo a expressão dos intervenientes a jusante, como a MMP9 e o MEF2C. No geral, estes resultados revelaram que os inibidores duplos do EGFR e do PI3Kp110β são mais eficazes do que os inibidores simples, o que indica a relevância de terapêuticas multi-alvo. De realçar que tais inibidores duplos podem modular a via EGFR/PI3K, controlando a morte das células tumorais, a migração e o ciclo celular, afetando especificamente alvos a jusante. Assim, coletivamente, os achados obtidos abrem portas para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para combater o BCBM. |
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