Publicação

Molecular mechanisms underlying vascular problems in Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A Doença Poliquística Renal Autossómica Dominante (ADPKD do inglês Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease) é uma doença crónica renal hereditária que afeta 1 em 400-1000 recém-nascidos em todo o mundo. É causada por mutações, maioritariamente, nos genes PKD1 (78% dos casos) e PKD2 (15% dos casos) que codificam as proteínas policistina-1 (PC1) e policistina-2 (PC2). Estas encontram-se localizadas em diversas estruturas celulares, porém, especialmente, a PC1 e a PC2 formam um complexo mecanossensorial na membrana dos cílios primários no epitélio renal, atuando respetivamente como um mecanossensor de estímulos extracelulares (como o fluxo de urina) e como um canal não seletivo de Ca2+. Este complexo é essencial para a homeostase do Ca2+ e, consequentemente, para a diferenciação e manutenção do epitélio renal. Adicionalmente, recentemente, também foram descobertos dois novos genes ligados a casos de ADPKD: GANAB e DNAJB11 (3% e 1,2% dos casos, respetivamente)¸ cujas proteínas se pensa estarem associadas à maturação e deslocação de proteínas transmembranares, particularmente a PC1. Na ADPKD, a disrupção destas proteínas leva a uma diminuição nos níveis basais de Ca2+ intracelular, provocando um aumento dos níveis de AMP cíclico (cAMP) e a desregulação de várias outras vias de sinalização, iniciando a cistogénese. Desta forma, desenvolvem-se múltiplos quistos renais cheios de fluído, cujo epitélio apresenta várias características patológicas, incluindo proliferação aumentada, apoptose aumentada, remodelação da matriz extracelular, fenótipo secretor, metabolismo desregulado e polaridade celular aberrante. A formação e inflação contínuas destes quistos, que constitui a principal manifestação clínica desta doença, destrói gradualmente o parênquima renal e, eventualmente, leva à insuficiência renal. A severidade da doença varia consoante o gene afetado, sendo que mutações no gene PKD1 estão associadas um fenótipo mais grave. No entanto, as manifestações da ADPKD não se limitam a este órgão; na verdade, é uma doença sistémica que leva a muitas complicações extrarrenais, como doença poliquística hepática, desenvolvimento de quistos no pâncreas, membrana aracnoide e vesícula seminal, diverticulose e diverticulite do cólon. Mas para além disto, esta doença também está associada a anomalias vasculares, que podem levar a aneurismas intracranianos, disseção e regurgitação da aorta, valvulopatias e hipertensão, que foram o foco deste projeto. Evidências na literatura mostram que a PC2 é expressa nas células endoteliais e musculares lisas vasculares, sugerindo uma importante função desta proteína no sistema cardiovascular. De facto, foi demonstrado que, nas células endoteliais vasculares, a ativação da PC2, pela tensão na parede dos vasos, resulta na dilatação do músculo liso e relaxamento vascular induzido pelo fluxo. Além disso, a PC2 também tem sido implicada na deteção da pressão de volume nas células do músculo liso vascular e na resposta miogénica. No entanto, a contribuição do canal PC2 para as alterações vasculares observadas em pacientes com ADPKD permanece incerta. Tendo em conta que a sequência e função desta policistina no peixe-zebra (Danio rerio) é altamente conservada com o ortólogo humano e dado o potencial deste organismo modelo para estudar a formação e doença da vasculatura, o nosso grupo postulou que a ausência de pkd2 levaria a anomalias vasculares nestes animais. Desta forma, escolhemos usar linhas de peixe-zebra para realizar as nossas observações in vivo da vasculatura embrionária, através de microscopia estereoscópica de fluorescência. Assim sendo, caracterizamos a vasculatura normal destes animais e as anomalias cardiovasculares causadas pela falta de Pkd2, usando algumas ferramentas. Primeiramente, usando um morfolino bloqueador de tradução do mRNA alvo, injetado em embriões (no estádio de uma célula) da linha Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2. Esta linha transgénica expressa GFP sob o controlo do promotor do gene fli1, assim como, dsRed sob o controlo do promotor do gene gata1a, e, portanto, marca células endoteliais vasculares e glóbulos vermelhos ao longo da embriogénese, respetivamente. O que nos permitiu discriminar anomalias na vasculatura relacionadas com a falta de Pkd2 até às 48 horas após a fertilização (hfp). E, por outro lado, gerando a linha mutante curly up (cup)tc321 × Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2, cruzando indivíduos heterozigóticos da linha mutante curly up (cup)tc321 com indivíduos da linha Tg(fli1:eGFP; gata1a:dsRed)y1;sd2. Os primeiros possuem uma mutação em cup, que codifica o ortólogo do peixe-zebra do gene PKD2 humano, levando a uma proteína truncada não-funcional. Esta linha permitiu-nos observar os embriões às 48, 72 e 96 hpf e, mais uma vez, com a marcação das células endoteliais vasculares e glóbulos vermelhos, para analisar anomalias vasculares. Os nossos resultados evidenciaram que os pkd2-morphants apresentavam várias anomalias cardiovasculares, o que foi consistente com o que era esperado e o que fora reportado em alguns trabalhos de investigação, que incluíam: defeitos in situ cardíacos, edema cardíaco, hemorragias intracranianas e hidrocefalia; que podem estar ligadas à interrupção das vias dependentes de pkd2 nos estágios iniciais de desenvolvimento, nomeadamente de vias responsáveis pela manutenção e função da vasculatura, que envolvem a matriz extracelular, a hipertensão e inflamação. Os defeitos observados no plexo da veia caudal e nos vasos intersegmentares não foram significativamente associados à falta de Pkd2, sugerindo um efeito off-target do morfolino ou possivelmente um ligeiro atraso no desenvolvimento associado ao uso de morfolino. No entanto, nem todos os fenótipos foram encontrados em cup-/- mutants, mesmo aquando da sua observação em estádios de desenvolvimento posteriores. De facto, o edema cardíaco foi o principal defeito cardiovascular detetado nestes animais. As razões por trás da ausência de alguns defeitos vasculares em cup-/- mutants que foram observados em pkd2-morphants, podem ser atribuídas a efeitos off-target do pkd2-augMO em pkd2-morphants ou à significativa contribuição materna de mRNA de pkd2 presente em cup-/- mutants já descrita na literatura, que pode atenuar fenótipos defeituosos. De facto, esta pode ser a principal contribuinte para as nossas observações em cup-/- mutants, visto que, à medida que a contribuição materna de Pkd2 foi progressivamente silenciada, o edema cardíaco foi agravando ao longo do desenvolvimento embrionário. Isto demonstrou a necessidade de uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares pelos quais o pkd2 poderá influenciar a vasculatura. De facto, para entender melhor os nossos resultados, será importante realizar no futuro ensaios de imunolocalização em vasos sanguíneos de pkd2-morphants e cup-/- mutants, e respetivos controlos assim como continuar a observar cup-/-mutants até aos 6 dias após a fertilização, momento em que morrem devido a complicações de malformação. Adicionalmente, foram realizadas medições do diâmetro da aorta dorsal em 5 diferentes localizações: 5º, 10º, 15º, 20º e 25º miótomo (unidade muscular do peixe-zebra). As medições do diâmetro da aorta dorsal de 48 hpf em ambos pkd2-morphants e cup-/- mutants mostraram que este vaso apresentava um calibre significativamente reduzido, o que parece ser causado por vasoconstrição. Esta diferença não foi verificada em estádios de desenvolvimento posteriores em cup-/- mutants, o que sugere que a Pkd2 poderá ter um papel mais determinante na vasculatura em estádios iniciais da embriogénese ou que as forças mecânicas que regulam a remodelação vascular após as 48 hpf são suficientes para esta ocorrer e que estes mecanismos podem ser independentes da função da Pkd2. Para além disto, os nossos resultados preliminares mostram claramente que a análise por microscopia confocal pode oferecer uma caracterização mais precisa destas anomalias. Concluindo, o nosso trabalho demonstra que a linha de peixe-zebra que criámos: curly up (cup)tc321 × Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2 é um ótimo modelo não só para observar e caracterizar problemas vasculares em vários estádios do desenvolvimento embrionário, mas também para estudar os mecanismos moleculares subjacentes a essas alterações devido à perda de pkd2.
Autores principais:	Sousa, Patrícia Martins de
Assunto:	Doença Poliquística Renal Autossómica Dominante (ADPKD) Policistina-2 (PC2) Peixe-zebra (Danio rerio) Problemas vasculares Hipertensão Teses de mestrado - 2021
Ano:	2021
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A Doença Poliquística Renal Autossómica Dominante (ADPKD do inglês Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease) é uma doença crónica renal hereditária que afeta 1 em 400-1000 recém-nascidos em todo o mundo. É causada por mutações, maioritariamente, nos genes PKD1 (78% dos casos) e PKD2 (15% dos casos) que codificam as proteínas policistina-1 (PC1) e policistina-2 (PC2). Estas encontram-se localizadas em diversas estruturas celulares, porém, especialmente, a PC1 e a PC2 formam um complexo mecanossensorial na membrana dos cílios primários no epitélio renal, atuando respetivamente como um mecanossensor de estímulos extracelulares (como o fluxo de urina) e como um canal não seletivo de Ca2+. Este complexo é essencial para a homeostase do Ca2+ e, consequentemente, para a diferenciação e manutenção do epitélio renal. Adicionalmente, recentemente, também foram descobertos dois novos genes ligados a casos de ADPKD: GANAB e DNAJB11 (3% e 1,2% dos casos, respetivamente)¸ cujas proteínas se pensa estarem associadas à maturação e deslocação de proteínas transmembranares, particularmente a PC1. Na ADPKD, a disrupção destas proteínas leva a uma diminuição nos níveis basais de Ca2+ intracelular, provocando um aumento dos níveis de AMP cíclico (cAMP) e a desregulação de várias outras vias de sinalização, iniciando a cistogénese. Desta forma, desenvolvem-se múltiplos quistos renais cheios de fluído, cujo epitélio apresenta várias características patológicas, incluindo proliferação aumentada, apoptose aumentada, remodelação da matriz extracelular, fenótipo secretor, metabolismo desregulado e polaridade celular aberrante. A formação e inflação contínuas destes quistos, que constitui a principal manifestação clínica desta doença, destrói gradualmente o parênquima renal e, eventualmente, leva à insuficiência renal. A severidade da doença varia consoante o gene afetado, sendo que mutações no gene PKD1 estão associadas um fenótipo mais grave. No entanto, as manifestações da ADPKD não se limitam a este órgão; na verdade, é uma doença sistémica que leva a muitas complicações extrarrenais, como doença poliquística hepática, desenvolvimento de quistos no pâncreas, membrana aracnoide e vesícula seminal, diverticulose e diverticulite do cólon. Mas para além disto, esta doença também está associada a anomalias vasculares, que podem levar a aneurismas intracranianos, disseção e regurgitação da aorta, valvulopatias e hipertensão, que foram o foco deste projeto. Evidências na literatura mostram que a PC2 é expressa nas células endoteliais e musculares lisas vasculares, sugerindo uma importante função desta proteína no sistema cardiovascular. De facto, foi demonstrado que, nas células endoteliais vasculares, a ativação da PC2, pela tensão na parede dos vasos, resulta na dilatação do músculo liso e relaxamento vascular induzido pelo fluxo. Além disso, a PC2 também tem sido implicada na deteção da pressão de volume nas células do músculo liso vascular e na resposta miogénica. No entanto, a contribuição do canal PC2 para as alterações vasculares observadas em pacientes com ADPKD permanece incerta. Tendo em conta que a sequência e função desta policistina no peixe-zebra (Danio rerio) é altamente conservada com o ortólogo humano e dado o potencial deste organismo modelo para estudar a formação e doença da vasculatura, o nosso grupo postulou que a ausência de pkd2 levaria a anomalias vasculares nestes animais. Desta forma, escolhemos usar linhas de peixe-zebra para realizar as nossas observações in vivo da vasculatura embrionária, através de microscopia estereoscópica de fluorescência. Assim sendo, caracterizamos a vasculatura normal destes animais e as anomalias cardiovasculares causadas pela falta de Pkd2, usando algumas ferramentas. Primeiramente, usando um morfolino bloqueador de tradução do mRNA alvo, injetado em embriões (no estádio de uma célula) da linha Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2. Esta linha transgénica expressa GFP sob o controlo do promotor do gene fli1, assim como, dsRed sob o controlo do promotor do gene gata1a, e, portanto, marca células endoteliais vasculares e glóbulos vermelhos ao longo da embriogénese, respetivamente. O que nos permitiu discriminar anomalias na vasculatura relacionadas com a falta de Pkd2 até às 48 horas após a fertilização (hfp). E, por outro lado, gerando a linha mutante curly up (cup)tc321 × Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2, cruzando indivíduos heterozigóticos da linha mutante curly up (cup)tc321 com indivíduos da linha Tg(fli1:eGFP; gata1a:dsRed)y1;sd2. Os primeiros possuem uma mutação em cup, que codifica o ortólogo do peixe-zebra do gene PKD2 humano, levando a uma proteína truncada não-funcional. Esta linha permitiu-nos observar os embriões às 48, 72 e 96 hpf e, mais uma vez, com a marcação das células endoteliais vasculares e glóbulos vermelhos, para analisar anomalias vasculares. Os nossos resultados evidenciaram que os pkd2-morphants apresentavam várias anomalias cardiovasculares, o que foi consistente com o que era esperado e o que fora reportado em alguns trabalhos de investigação, que incluíam: defeitos in situ cardíacos, edema cardíaco, hemorragias intracranianas e hidrocefalia; que podem estar ligadas à interrupção das vias dependentes de pkd2 nos estágios iniciais de desenvolvimento, nomeadamente de vias responsáveis pela manutenção e função da vasculatura, que envolvem a matriz extracelular, a hipertensão e inflamação. Os defeitos observados no plexo da veia caudal e nos vasos intersegmentares não foram significativamente associados à falta de Pkd2, sugerindo um efeito off-target do morfolino ou possivelmente um ligeiro atraso no desenvolvimento associado ao uso de morfolino. No entanto, nem todos os fenótipos foram encontrados em cup-/- mutants, mesmo aquando da sua observação em estádios de desenvolvimento posteriores. De facto, o edema cardíaco foi o principal defeito cardiovascular detetado nestes animais. As razões por trás da ausência de alguns defeitos vasculares em cup-/- mutants que foram observados em pkd2-morphants, podem ser atribuídas a efeitos off-target do pkd2-augMO em pkd2-morphants ou à significativa contribuição materna de mRNA de pkd2 presente em cup-/- mutants já descrita na literatura, que pode atenuar fenótipos defeituosos. De facto, esta pode ser a principal contribuinte para as nossas observações em cup-/- mutants, visto que, à medida que a contribuição materna de Pkd2 foi progressivamente silenciada, o edema cardíaco foi agravando ao longo do desenvolvimento embrionário. Isto demonstrou a necessidade de uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares pelos quais o pkd2 poderá influenciar a vasculatura. De facto, para entender melhor os nossos resultados, será importante realizar no futuro ensaios de imunolocalização em vasos sanguíneos de pkd2-morphants e cup-/- mutants, e respetivos controlos assim como continuar a observar cup-/-mutants até aos 6 dias após a fertilização, momento em que morrem devido a complicações de malformação. Adicionalmente, foram realizadas medições do diâmetro da aorta dorsal em 5 diferentes localizações: 5º, 10º, 15º, 20º e 25º miótomo (unidade muscular do peixe-zebra). As medições do diâmetro da aorta dorsal de 48 hpf em ambos pkd2-morphants e cup-/- mutants mostraram que este vaso apresentava um calibre significativamente reduzido, o que parece ser causado por vasoconstrição. Esta diferença não foi verificada em estádios de desenvolvimento posteriores em cup-/- mutants, o que sugere que a Pkd2 poderá ter um papel mais determinante na vasculatura em estádios iniciais da embriogénese ou que as forças mecânicas que regulam a remodelação vascular após as 48 hpf são suficientes para esta ocorrer e que estes mecanismos podem ser independentes da função da Pkd2. Para além disto, os nossos resultados preliminares mostram claramente que a análise por microscopia confocal pode oferecer uma caracterização mais precisa destas anomalias. Concluindo, o nosso trabalho demonstra que a linha de peixe-zebra que criámos: curly up (cup)tc321 × Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2 é um ótimo modelo não só para observar e caracterizar problemas vasculares em vários estádios do desenvolvimento embrionário, mas também para estudar os mecanismos moleculares subjacentes a essas alterações devido à perda de pkd2.