Publicação
Splicing modulation to rescue the repair activity of a biallelic BRCA2 mutant in a patient derived cell line
| Resumo: | Através de splicing alternativo, um conjunto de transcritos de BRCA1 e BRCA2 expressos em células portadoras de variantes associadas ao cancro hereditário pode codificar proteínas internamente truncadas, mas funcionais. Até à data, uma análise sistemática da abundância e funcionalidade das proteínas resultantes de isoformas de splicing específicas ainda não foi realizada. Aqui, usámos a variante BRCA2:c.681+5G>C, que induz o skipping do exão 8, como modelo. Tirando proveito da alta precisão e sensibilidade do “One-step droplet digital RT-PCR” (ddRT-PCR), identificámos e quantificámos duas isoformas de mRNA específicas da variante expressas em células homozigóticas para a variante alélica. A isoforma de transcrito mais abundante apresenta alteração do quadro de leitura, a qual gera um codão de terminação prematuro (PTC) resultando na sua degradação por “nonsense-mediated mRNA decay” (NMD). Uma isoforma alternativa, menos abundante, foi identificada. Esta apresenta recuperação do quadro de leitura, prevendo-se que codifique uma proteína internamente truncada, sem domínios não essenciais. No entanto, apesar da presença da proteína BRCA2, avaliada por “WesternBlot”, as células portadoras da variante em homozigotia apresentam defeitos na reparação do DNA. Para testar a hipótese de que a isoforma de splicing menor não produz proteína BRCA2 com capacidade funcional suficiente, usámos edição genómica mediada por CRISPR-Cas9 para induzir o “skipping” do exão 7 nas células mutantes, visando a produção de transcritos com o quadro de leitura corrigido. Em comparação com as células derivadas dos doentes, as células editadas geneticamente formaram significativamente mais focos de RAD51 após exposição ao etoposido e mostraram significativamente menos quebras cromossómicas induzidas por mitomicina C. Estes resultados apresentam uma evidência para o potencial terapêutico da modulação de “splicing”, através da indução da produção de transcritos com o quadro de leitura correto mesmo que truncados em alguns exões não essenciais, como estratégia para resgatar a função de BRCA2 em células mutantes, prevenindo assim o desenvolvimento de cancro. |
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| Autores principais: | Lima, Beatriz Anjo Santos |
| Assunto: | Genes BRCA2 Modulação de splicing VUS Proteína 9 associada à CRISPR Biologia molecular |
| Ano: | 2024 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | Através de splicing alternativo, um conjunto de transcritos de BRCA1 e BRCA2 expressos em células portadoras de variantes associadas ao cancro hereditário pode codificar proteínas internamente truncadas, mas funcionais. Até à data, uma análise sistemática da abundância e funcionalidade das proteínas resultantes de isoformas de splicing específicas ainda não foi realizada. Aqui, usámos a variante BRCA2:c.681+5G>C, que induz o skipping do exão 8, como modelo. Tirando proveito da alta precisão e sensibilidade do “One-step droplet digital RT-PCR” (ddRT-PCR), identificámos e quantificámos duas isoformas de mRNA específicas da variante expressas em células homozigóticas para a variante alélica. A isoforma de transcrito mais abundante apresenta alteração do quadro de leitura, a qual gera um codão de terminação prematuro (PTC) resultando na sua degradação por “nonsense-mediated mRNA decay” (NMD). Uma isoforma alternativa, menos abundante, foi identificada. Esta apresenta recuperação do quadro de leitura, prevendo-se que codifique uma proteína internamente truncada, sem domínios não essenciais. No entanto, apesar da presença da proteína BRCA2, avaliada por “WesternBlot”, as células portadoras da variante em homozigotia apresentam defeitos na reparação do DNA. Para testar a hipótese de que a isoforma de splicing menor não produz proteína BRCA2 com capacidade funcional suficiente, usámos edição genómica mediada por CRISPR-Cas9 para induzir o “skipping” do exão 7 nas células mutantes, visando a produção de transcritos com o quadro de leitura corrigido. Em comparação com as células derivadas dos doentes, as células editadas geneticamente formaram significativamente mais focos de RAD51 após exposição ao etoposido e mostraram significativamente menos quebras cromossómicas induzidas por mitomicina C. Estes resultados apresentam uma evidência para o potencial terapêutico da modulação de “splicing”, através da indução da produção de transcritos com o quadro de leitura correto mesmo que truncados em alguns exões não essenciais, como estratégia para resgatar a função de BRCA2 em células mutantes, prevenindo assim o desenvolvimento de cancro. |
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