Publicação
Continuous alkaline lysis of plasmid-containing E. colicells using an oscillatory flow reactor
| Resumo: | Avanços na terapia genética e vacinação com DNA, aumentam a necessidade de produção em larga escala de DNA plasmídico (pDNA). Uma etapa crítica neste processo é a lise celular, geralmente por lise alcalina, é desafiante na produção industrial de pDNA e na adaptação à produção em contínuo. Durante a lise, a libertação de DNA aumenta a viscosidade do lisado, dificultando a mistura e exigindo controlo de pH e tempo de residência para desnaturar o DNA cromossómico sem degradar o pDNA, evitando extremos de pH localizados e forças de cisalhamento. É ainda necessário separar uma quantidade significativa de precipitado do lisado. Este estudo avalia a viabilidade da lise alcalina em contínuo num reator de fluxo oscilatório (OFR), testando diferentes condições de amplitude e frequência de oscilação, para mistura adequada e maximização do rendimento pDNA. Demonstrou-se que a frequência de oscilação afeta o rendimento de pDNA e a amplitude de oscilação afeta a percentagem de pDNA superenrolado (sc). O rendimento de pDNA foi semelhante ou superior ao processo em batch, com o maior rendimento obtido a uma amplitude de 1 mm e frequência de 5 Hz, recuperando mais de 60% de pDNA sc. Alta amplitude e frequência de oscilação geram uma mistura mais intensa, diminuindo o rendimento e percentagem de pDNA sc. Avaliou-se ainda o impacto do tempo de residência e concentração de células. Um tempo de residência mais curto de 2,5 minutos no OFR não afetou o rendimento de pDNA, no entanto, tempo de residência de 10 minutos resultou em agregados e menor rendimento de pDNA. Aumentando a concentração de células até DO600nm de 59, o pDNA recuperado foi 4 vezes superior processo em batch, que se manteve consistente independentemente do aumento da concentração celular. Embora sejam necessários mais estudos, lise alcalina contínua pode mitigar limitações na produção industrial de pDNA. |
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| Autores principais: | Lopes, Carla Cristina dos Reis |
| Assunto: | Plasmid DNA Continuous manufacturing Oscillatory flow reactor Downstream processing Alkaline lysis Teses de mestrado - 2024 |
| Ano: | 2024 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | Avanços na terapia genética e vacinação com DNA, aumentam a necessidade de produção em larga escala de DNA plasmídico (pDNA). Uma etapa crítica neste processo é a lise celular, geralmente por lise alcalina, é desafiante na produção industrial de pDNA e na adaptação à produção em contínuo. Durante a lise, a libertação de DNA aumenta a viscosidade do lisado, dificultando a mistura e exigindo controlo de pH e tempo de residência para desnaturar o DNA cromossómico sem degradar o pDNA, evitando extremos de pH localizados e forças de cisalhamento. É ainda necessário separar uma quantidade significativa de precipitado do lisado. Este estudo avalia a viabilidade da lise alcalina em contínuo num reator de fluxo oscilatório (OFR), testando diferentes condições de amplitude e frequência de oscilação, para mistura adequada e maximização do rendimento pDNA. Demonstrou-se que a frequência de oscilação afeta o rendimento de pDNA e a amplitude de oscilação afeta a percentagem de pDNA superenrolado (sc). O rendimento de pDNA foi semelhante ou superior ao processo em batch, com o maior rendimento obtido a uma amplitude de 1 mm e frequência de 5 Hz, recuperando mais de 60% de pDNA sc. Alta amplitude e frequência de oscilação geram uma mistura mais intensa, diminuindo o rendimento e percentagem de pDNA sc. Avaliou-se ainda o impacto do tempo de residência e concentração de células. Um tempo de residência mais curto de 2,5 minutos no OFR não afetou o rendimento de pDNA, no entanto, tempo de residência de 10 minutos resultou em agregados e menor rendimento de pDNA. Aumentando a concentração de células até DO600nm de 59, o pDNA recuperado foi 4 vezes superior processo em batch, que se manteve consistente independentemente do aumento da concentração celular. Embora sejam necessários mais estudos, lise alcalina contínua pode mitigar limitações na produção industrial de pDNA. |
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