Publicação

Tradução independente de cap da proteína humana up-frameshift 1 (UPF1) e cancro

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A regulação da síntese proteica desempenha um papel crítico no crescimento celular. O início da tradução é fortemente regulado por uma concentração equilibrada de fatores envolvidos na síntese das proteínas e é considerada um passo limitante da síntese proteica. Na maioria dos casos (tradução canónica), o início da tradução é um mecanismo dependente de cap, que se inicia com o recrutamento da subunidade 40S do ribossoma e vários fatores de iniciação, para a estrutura cap, localizada na extremidade 5’ do mRNA. De seguida, este complexo denominado 48S, faz a leitura de toda a região 5’ transcrita não-traduzida (UTR, do inglês untranslated region) até atingir o primeiro codão de iniciação em contexto de Kozak favorável. Contudo, vários transcritos, entre os quais oncogenes, fatores de crescimento e proteínas envolvidas na regulação da morte celular programada, conseguem manter os seus níveis de expressão proteica em circunstâncias que condicionam a iniciação canónica da tradução. Este mecanismo alternativo de iniciação da tradução ocorre sem a necessidade de reconhecimento da estrutura cap e/ou de leitura da 5’UTR. Como exemplo, temos a tradução independente de cap mediada por um local interno de entrada do ribossoma (IRES, do inglês internal ribossome entry site). A tradução mediada por IRES requer várias proteínas atuando em trans, conhecidas como ITAF (do inglês IRES trans-acting factor). Este mecanismo envolve o recrutamento direto do ribossoma para a vizinhança do codão de iniciação sem o envolvimento da estrutura cap. Este mecanismo não-canónico de iniciação da tradução pode sustentar a síntese proteica sob condições de stress e promover/combater a tumorigénese. A up-frameshift 1 humana (UPF1, do inglês up-frameshift 1) é uma proteína-chave envolvida no mecanismo de degradação rápida de ácidos ribonucleicos mensageiros (mRNA do inglês messenger ribonucleic) portadores de mutações nonsense (NMD, do inglês nonsense-mediated mRNA decay), replicação e homeostase de telómeros, e progressão do ciclo celular, desempenhando por isso um papel crucial na célula. Resultados anteriores do grupo de investigação onde desenvolvi este trabalho mostram que esta proteína tem a capacidade de ser traduzida de forma independente de cap, mediada por IRES, em condições normais, mas também em condições prejudiciais à iniciação da tradução canónica, como hipóxia ou stress do retículo endoplasmático, em linhas celulares de cancro do colo do útero e colorretal. Na presente dissertação, propusemos caracterizar o significado biológico da tradução mediada pelo IRES existente na 5’UTR de UPF1. Para tal, testámos a relevância da xiv tradução independente de cap de UPF1 em mecanismos em que esta é crucial, tal como o NMD, através do silenciamento de UPF1 endógeno recorrendo a siRNA digiridos à 3’UTR de UPF1 e promovendo a tradução de UPF1 de forma independente de cap recorrendo a mRNA transcritos in vitro a partir dos plasmídeos em estudo. Os resultados do silenciamento de UPF1 foram bastante eficazes, no entanto, não foi possível obter resultados com diferenças significativas entre os níveis de expressão de mRNA controlo e mRNA com o IRES da 5’UTR de UPF1. É necessário utilizar um plasmídeo dicistrónico para obter resultados mais fiáveis relativamente à funcionalidade biológica de UPF1 traduzida via IRES cujas clonagens já foram conseguidas. Acreditamos que os resultados obtidos são o primeiro passo para uma melhor caracterização de UPF1 traduzida via IRES, podendo este mecanismo ser bastante útil no desenvolvimento de novas terapias no combate ao cancro.
Autores principais:	Bacalhau, Neuza Sofia Augusto Silva
Assunto:	Expressão génica eucariótica Iniciação da tradução Tradução independente da estrutura cap Local interno de entrada do ribossoma (IRES) UP-Frameshift 1 (UPF1)
Ano:	2021
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	português
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A regulação da síntese proteica desempenha um papel crítico no crescimento celular. O início da tradução é fortemente regulado por uma concentração equilibrada de fatores envolvidos na síntese das proteínas e é considerada um passo limitante da síntese proteica. Na maioria dos casos (tradução canónica), o início da tradução é um mecanismo dependente de cap, que se inicia com o recrutamento da subunidade 40S do ribossoma e vários fatores de iniciação, para a estrutura cap, localizada na extremidade 5’ do mRNA. De seguida, este complexo denominado 48S, faz a leitura de toda a região 5’ transcrita não-traduzida (UTR, do inglês untranslated region) até atingir o primeiro codão de iniciação em contexto de Kozak favorável. Contudo, vários transcritos, entre os quais oncogenes, fatores de crescimento e proteínas envolvidas na regulação da morte celular programada, conseguem manter os seus níveis de expressão proteica em circunstâncias que condicionam a iniciação canónica da tradução. Este mecanismo alternativo de iniciação da tradução ocorre sem a necessidade de reconhecimento da estrutura cap e/ou de leitura da 5’UTR. Como exemplo, temos a tradução independente de cap mediada por um local interno de entrada do ribossoma (IRES, do inglês internal ribossome entry site). A tradução mediada por IRES requer várias proteínas atuando em trans, conhecidas como ITAF (do inglês IRES trans-acting factor). Este mecanismo envolve o recrutamento direto do ribossoma para a vizinhança do codão de iniciação sem o envolvimento da estrutura cap. Este mecanismo não-canónico de iniciação da tradução pode sustentar a síntese proteica sob condições de stress e promover/combater a tumorigénese. A up-frameshift 1 humana (UPF1, do inglês up-frameshift 1) é uma proteína-chave envolvida no mecanismo de degradação rápida de ácidos ribonucleicos mensageiros (mRNA do inglês messenger ribonucleic) portadores de mutações nonsense (NMD, do inglês nonsense-mediated mRNA decay), replicação e homeostase de telómeros, e progressão do ciclo celular, desempenhando por isso um papel crucial na célula. Resultados anteriores do grupo de investigação onde desenvolvi este trabalho mostram que esta proteína tem a capacidade de ser traduzida de forma independente de cap, mediada por IRES, em condições normais, mas também em condições prejudiciais à iniciação da tradução canónica, como hipóxia ou stress do retículo endoplasmático, em linhas celulares de cancro do colo do útero e colorretal. Na presente dissertação, propusemos caracterizar o significado biológico da tradução mediada pelo IRES existente na 5’UTR de UPF1. Para tal, testámos a relevância da xiv tradução independente de cap de UPF1 em mecanismos em que esta é crucial, tal como o NMD, através do silenciamento de UPF1 endógeno recorrendo a siRNA digiridos à 3’UTR de UPF1 e promovendo a tradução de UPF1 de forma independente de cap recorrendo a mRNA transcritos in vitro a partir dos plasmídeos em estudo. Os resultados do silenciamento de UPF1 foram bastante eficazes, no entanto, não foi possível obter resultados com diferenças significativas entre os níveis de expressão de mRNA controlo e mRNA com o IRES da 5’UTR de UPF1. É necessário utilizar um plasmídeo dicistrónico para obter resultados mais fiáveis relativamente à funcionalidade biológica de UPF1 traduzida via IRES cujas clonagens já foram conseguidas. Acreditamos que os resultados obtidos são o primeiro passo para uma melhor caracterização de UPF1 traduzida via IRES, podendo este mecanismo ser bastante útil no desenvolvimento de novas terapias no combate ao cancro.