Publicação
The role of necroptotic extracellular vesicles in NAFLD pathogenesis
| Resumo: | As vesículas extracelulares (EVs), envolvidas na comunicação intercelular e a necroptose, uma via de necrose regulada, cuja maquinaria facilita o tráfico endosomal e a geração de EVs, foram recentemente implicadas na patogénese de fígado gordo não alcoólico (NAFLD). Neste trabalho tivemos como objetivo caracterizar o papel funcional da maquinaria necroptótica na geração de EVs provenientes de hepatócitos (Hep-EVs) e o seu impacto na função dos hepatócitos com sobrecarga lípidica. Hep-EVs foram isoladas por precipitação a partir de células AML12 wild-type (WT), deficientes em Ripk3 e em Mlkl na presença ou ausência de 125 µM ácido palmítico (PA) durante 24h, sendo depois caracterizadas por immunoblotting e análise de rastreamento de nanoparticulas. De seguida, após 1h de pré-exposição a 10 µg/mL Hep-EVs, os hepatócitos foram incubados com 125 µM PA por 48h, seguido de avaliação da morte celular e do metabolismo lípidico. Os nossos resultados mostram que a incubação com PA aumenta a secreção de Hep-EVs, um fenótipo que é dependente da maquinaria necroptótica. Em contraste com os hepatócitos Mlkl-/-, os hepatócitos Ripk3-/- estiveram protegidos da morte celular provocada pelo PA, a qual por sua vez não foi afetada pela exposição a EVs. Ainda assim, as EVs derivadas de células WT tratadas com PA aumentaram ainda mais os níveis de RIPK3 em células WT tratadas com PA, um efeito que foi anulado pela deficiência em Ripk3. De igual modo, embora os hepatócitos Ripk3-/- tenham uma expressão aumentada de enzimas lipogénicas, estas células apresentaram menor acumulação lipídica, a qual foi ainda mais reduzida pela incubação com Ripk3-/- Hep-EVs. Este efeito foi concomitante com o aumento da expressão de marcadores de β-oxidação e autofagia. Por fim, as células Ripk3-/- apresentam níveis diminuídos de NLRP3 e Tgf-β, indicando que a RIPK3 pode regular a ativação do inflamassoma e a sinalização profibrogénica após sobrecarga lipídica. Em conclusão, a deficiência em Ripk3 protegeu os hepatócitos da lipotoxicidade, acompanhada pela redução da expressão de mediadores pró-inflamatórios e fibrogénicos, bem como alterações no metabolismo lipídico. Além disso, EVs necroptóticos podem ter um papel na comunicação hepatocelular, particularmente afetando o metabolismo lipídico e os níveis de RIPK3 nos hepatócitos vizinhos, provavelmente contribuindo para a patogénese de NAFLD. |
|---|---|
| Autores principais: | Campino, Gonçalo Marques de Sousa |
| Assunto: | Necroptosis Extracellular vesicles Non-alcoholic fatty liver disease Teses de mestrado - 2022 |
| Ano: | 2022 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | As vesículas extracelulares (EVs), envolvidas na comunicação intercelular e a necroptose, uma via de necrose regulada, cuja maquinaria facilita o tráfico endosomal e a geração de EVs, foram recentemente implicadas na patogénese de fígado gordo não alcoólico (NAFLD). Neste trabalho tivemos como objetivo caracterizar o papel funcional da maquinaria necroptótica na geração de EVs provenientes de hepatócitos (Hep-EVs) e o seu impacto na função dos hepatócitos com sobrecarga lípidica. Hep-EVs foram isoladas por precipitação a partir de células AML12 wild-type (WT), deficientes em Ripk3 e em Mlkl na presença ou ausência de 125 µM ácido palmítico (PA) durante 24h, sendo depois caracterizadas por immunoblotting e análise de rastreamento de nanoparticulas. De seguida, após 1h de pré-exposição a 10 µg/mL Hep-EVs, os hepatócitos foram incubados com 125 µM PA por 48h, seguido de avaliação da morte celular e do metabolismo lípidico. Os nossos resultados mostram que a incubação com PA aumenta a secreção de Hep-EVs, um fenótipo que é dependente da maquinaria necroptótica. Em contraste com os hepatócitos Mlkl-/-, os hepatócitos Ripk3-/- estiveram protegidos da morte celular provocada pelo PA, a qual por sua vez não foi afetada pela exposição a EVs. Ainda assim, as EVs derivadas de células WT tratadas com PA aumentaram ainda mais os níveis de RIPK3 em células WT tratadas com PA, um efeito que foi anulado pela deficiência em Ripk3. De igual modo, embora os hepatócitos Ripk3-/- tenham uma expressão aumentada de enzimas lipogénicas, estas células apresentaram menor acumulação lipídica, a qual foi ainda mais reduzida pela incubação com Ripk3-/- Hep-EVs. Este efeito foi concomitante com o aumento da expressão de marcadores de β-oxidação e autofagia. Por fim, as células Ripk3-/- apresentam níveis diminuídos de NLRP3 e Tgf-β, indicando que a RIPK3 pode regular a ativação do inflamassoma e a sinalização profibrogénica após sobrecarga lipídica. Em conclusão, a deficiência em Ripk3 protegeu os hepatócitos da lipotoxicidade, acompanhada pela redução da expressão de mediadores pró-inflamatórios e fibrogénicos, bem como alterações no metabolismo lipídico. Além disso, EVs necroptóticos podem ter um papel na comunicação hepatocelular, particularmente afetando o metabolismo lipídico e os níveis de RIPK3 nos hepatócitos vizinhos, provavelmente contribuindo para a patogénese de NAFLD. |
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