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Investigating the role of regulatory cysteine residues as functional redox switches in human persulfide dioxygenase
| Summary: | O sulfureto de hidrogénio (H2S) regula diversos processos fisio(pato)lógicos, exercendo o seu papel de sinalização numa estreita gama de concentrações, mantida pelas enzimas de síntese e destoxificação. Várias patologias estão associadas ao metabolismo disfuncional do H2S, nomeadamente à expressão das enzimas do seu metabolismo. Menos informação é conhecida acerca da regulação por modificações pós-traducionais (PTMs). O facto de estas enzimas possuírem um grande número de resíduos de cisteína não envolvidos em pontes dissulfureto sugere um papel regulador destes como interruptores redox. Este projeto visa estudar PTMs oxidativas tendo como alvos resíduos de cisteína, especificamente da dioxigenase de persulfureto (PDO) humana. A PDO wild-type recombinante e variantes com substituições Cys→Ser foram produzidas e caracterizadas por técnicas biofísicas como dicroísmo circular, differential scanning fluorimetry e dynamic light scattering, para analisar perturbações estruturais das substituições e/ou PTMs oxidativas. Observou-se que, embora a estrutura α-helical da PDO pareça inalterada, as substituições levaram à diminuição da estabilidade térmica e aumento da propensão para agregação, dependendo da variante. Medições de atividade por respirometria de alta resolução revelaram que a maioria das variantes estavam cataliticamente afetadas, provavelmente associado à exposição dos resíduos ao solvente e à proximidade ao Fe catalítico e aos locais de ligação do substrato. Utilizando as mesmas metodologias, observou-se que a s-cisteinilação afetou globalmente a estabilidade da PDO e, apesar de diminuir a atividade máxima, eliminou o mecanismo de auto-inibição, proporcionando assim estabilidade cinética. Relativamente à inibição observada na s-nitrosação, permanece incerto se este efeito é consequência da modificação ou do óxido nítrico liberado pela reação com o substrato persulfureto de glutationa. Ensaios de cristalização foram realizados para tentar obter informações estruturais detalhadas. No geral, os resultados relatados nesta dissertação apontam para um papel regulador dos resíduos de cisteína na PDO humana, com diferentes consequências possíveis sob diferentes condições fisiológicas. |
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| Main Authors: | Silva, Diogo Henrique Pires da |
| Subject: | Hydrogen sulfide Oxidative post-translational modifications Persulfide dioxygenase s-cysteinylation s-nitrosation Teses de mestrado - 2023 |
| Year: | 2023 |
| Country: | Portugal |
| Document type: | master thesis |
| Access type: | embargoed access |
| Associated institution: | Universidade de Lisboa |
| Language: | English |
| Origin: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Summary: | O sulfureto de hidrogénio (H2S) regula diversos processos fisio(pato)lógicos, exercendo o seu papel de sinalização numa estreita gama de concentrações, mantida pelas enzimas de síntese e destoxificação. Várias patologias estão associadas ao metabolismo disfuncional do H2S, nomeadamente à expressão das enzimas do seu metabolismo. Menos informação é conhecida acerca da regulação por modificações pós-traducionais (PTMs). O facto de estas enzimas possuírem um grande número de resíduos de cisteína não envolvidos em pontes dissulfureto sugere um papel regulador destes como interruptores redox. Este projeto visa estudar PTMs oxidativas tendo como alvos resíduos de cisteína, especificamente da dioxigenase de persulfureto (PDO) humana. A PDO wild-type recombinante e variantes com substituições Cys→Ser foram produzidas e caracterizadas por técnicas biofísicas como dicroísmo circular, differential scanning fluorimetry e dynamic light scattering, para analisar perturbações estruturais das substituições e/ou PTMs oxidativas. Observou-se que, embora a estrutura α-helical da PDO pareça inalterada, as substituições levaram à diminuição da estabilidade térmica e aumento da propensão para agregação, dependendo da variante. Medições de atividade por respirometria de alta resolução revelaram que a maioria das variantes estavam cataliticamente afetadas, provavelmente associado à exposição dos resíduos ao solvente e à proximidade ao Fe catalítico e aos locais de ligação do substrato. Utilizando as mesmas metodologias, observou-se que a s-cisteinilação afetou globalmente a estabilidade da PDO e, apesar de diminuir a atividade máxima, eliminou o mecanismo de auto-inibição, proporcionando assim estabilidade cinética. Relativamente à inibição observada na s-nitrosação, permanece incerto se este efeito é consequência da modificação ou do óxido nítrico liberado pela reação com o substrato persulfureto de glutationa. Ensaios de cristalização foram realizados para tentar obter informações estruturais detalhadas. No geral, os resultados relatados nesta dissertação apontam para um papel regulador dos resíduos de cisteína na PDO humana, com diferentes consequências possíveis sob diferentes condições fisiológicas. |
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