Publicação

Dissecting miRNA-194-5p's and MEF2C's roles in breast cancer brain metastases

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A nível global, o cancro mais diagnosticado em mulheres é o cancro da mama, tendo uma incidência de 2,3 milhões de novos casos por ano, o que levou à sua classificação como uma das principais causas de morte relacionada com o cancro. De entre os diversos subtipos de cancro da mama, o triplo negativo é considerado o subtipo mais agressivo, caracterizado por uma elevada propensão para desenvolver metástases, especialmente no parênquima encefálico. De facto, as metástases encefálicas de cancro da mama são um dos fatores que mais contribui para os elevados números de mortalidade em pacientes de cancro da mama, em muito devido à falta de terapias direcionadas e específicas para este subtipo. Durante o desenvolvimento de metástases, por um processo conhecido como a cascata metastática, as células tumorais sofrem alterações fenotípicas e morfológicas associadas sobretudo à ocorrência de um processo designado por transição epitelial-mesenquimal. Neste sentido, durante a transição epitelial-mesenquimal, as células tumorais perdem algumas das suas características epiteliais e adquirem um fenótipo parcial ou completamente mesenquimal, o que lhes confere propriedades de motilidade essenciais para processos invasivos que podem culminar na formação de metástases. No entanto, a complexidade que caracteriza a formação de metástases encefálicas de cancro da mama, especialmente derivadas do subtipo de cancro da mama triplo negativo, ainda é pouco compreendida. Por conseguinte, a descoberta de novas estratégias terapêuticas que consigam atuar na prevenção e mitigação das metástases de cancro da mama é necessária. Para tal, é imperativa a utilização de novos alvos passíveis de serem modulados e que visem prevenir ou atenuar o prognóstico associado à formação das metástases. Apesar das descobertas relativamente recentes no âmbito dos miRNAs e de proteínas oncogénicas, ainda há um longo caminho a percorrer para aumentar a sobrevivência global em pacientes com cancro da mama, especialmente aqueles que sofrem com a forma metastática de cancro da mama do subtipo triplo negativo. Estudos prévios realizados no nosso laboratório revelaram que o microRNA (miRNA ou miR)-194-5p está sub-expresso na corrente sanguínea numa fase inicial do desenvolvimento de metástases encefálicas de cancro da mama, o que aponta para que este miRNA possa ter um papel supressor no desenvolvimento de tumores. Através de uma análise bioinformática, foi também revelado que o fator de transcrição, conhecido como fator ativador do miócito 2C (MEF2C, do inglês myocyte enhancer factor 2C) é um alvo do miR-194-5p. Para além disso, a análise da expressão do MEF2C no parênquima encefálico, utilizando um modelo de ratinho da doença, demonstrou que este fator de transcrição tem uma expressão crescente ao longo do desenvolvimento de metástases encefálicas de cancro da mama. Adicionalmente, em amostras de pacientes com metástases encefálicas de cancro da mama, foi possível observar que com o aumento da severidade da doença, os níveis de MEF2C também incrementavam. Por estes motivos, tanto o miR-194-5p como o MEF2C surgem como novos intervenientes a serem estudados, com grande potencial para serem modulados e, desta forma, conseguir melhorar o prognóstico dos pacientes que sofrem de cancro da mama triplo negativo. Apesar da previsão in silico apontar para o MEF2C como um alvo do miR-194-5p, a causalidade entre a desregulação dos dois ainda não foi analisada até à data. Assim, este estudo pretende esclarecer o envolvimento tanto do MEF2C, tal como do miR-194-5p na tumorigénese, tentando estabelecer uma relação direta entre a sub-expressão deste miRNA e a sobre-expressão desta proteína. Adicionalmente, será determinante também perceber o papel do MEF2C e do miR-194-5p isoladamente nas propriedades metastáticas das células tumorais de cancro da mama. Uma linha celular de ratinho de cancro da mama triplo negativo (células 4T1) foi usada para as transfeções com um siRNA e um plasmídeo específicos para o MEF2C, ou com o pre-miR-194-5p, com o intuito de modular a expressão da proteína e do miRNA, respetivamente. As eficiências de modulação foram determinadas por real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) e por análise dos níveis de expressão do MEF2C e do miR-194-5p por imunofluorescência e por hibridização in situ, respetivamente. Em ambos os casos e após as modulações dos respetivos alvos, a viabilidade das células tumorais foi determinada pelo ensaio colorimétrico de MTT, enquanto as alterações fenotípicas das células foram avaliadas por imunofluorescência, analisando proteínas como a citoqueratina e a vimentina, marcadores epitelial e mesenquimal, respetivamente. Além disso, o comportamento migratório das células tumorais 4T1 foi seguido através da técnica de wound healing. Por último, o reflexo direto da modulação do miR-194-5p na expressão do MEF2C foi estudado recorrendo à análise dos níveis de mRNA e expressão proteica do MEF2C, através de RT-qPCR e análise de imunofluorescência respetivamente, ambos em células tumorais 4T1 a sobre-expressar o miR-194-5p. A modulação dos níveis de expressão do MEF2C foi conseguida com a transfeção de um siRNA e um plasmídeo, de forma a silenciar e sobre-expressar o MEF2C, respetivamente. O resultado do silenciamento do MEF2C foi confirmado pela redução significativa dos seus níveis de mRNA e da proteína. Apesar do aumento significativo dos níveis de mRNA do MEF2C, causado pelo plasmídeo, o mesmo não aconteceu com os seus níveis proteicos, uma vez que a eficiência de transfeção demonstrou ser consideravelmente baixa. Por esta razão, o plasmídeo usado para induzir a sobre-expressão do MEF2C foi excluído das restantes experiências em que se estudou o efeito desta proteína na tumorigénese das células de cancro da mama triplo negativo. Curiosamente, as células tumorais 4T1 que foram sujeitas ao silenciamento do MEF2C apresentaram uma diminuição na expressão tanto de vimentina como de citoqueratina, promovendo ainda uma perda significativa de capacidade migratória destas células. Por outro lado, o tratamento com o pre-miR-194-5p induziu um aumento dependente da dose na expressão do miRNA em células tumorais 4T1, embora com crescente toxicidade. Apesar da redução de viabilidade observada nas células tumorais tratadas com o pre-miR-194-5p a uma concentração de 30 nM, esta condição deverá ser estudada mais a fundo no futuro como uma possível opção terapêutica direcionada para as células tumorais de cancro da mama triplo negativo. A concentração não tóxica mais eficaz de pre-miR-194-5p (10 nM) foi selecionada e a sua expressão celular foi validada através de hibridização in situ, que mostrou novamente o aumento dos níveis celulares deste miR. Para além disso, a sobre-expressão do miR-194-5p promoveu ainda um aumento de citoqueratina e uma redução de vimentina, juntamente com uma diminuição significativa da capacidade migratória das células tumorais 4T1. Por fim, não foi possível estabelecer uma relação de causalidade entre o miR-194-5p e o MEF2C, uma vez que o aumento da expressão deste miR não induziu um efeito percetível nos níveis de mRNA nem proteicos do MEF2C. É importante realçar que com o intuito de perceber se o resultado anterior foi influenciado por algum mecanismo compensatório, foi feito um estudo adicional, a dois tempos diferentes (24 e 72 h). Ainda assim, não foi possível verificar a relação de causalidade entre o aumento da expressão do miR e o MEF2C. Coletivamente, os efeitos do silenciamento do MEF2C na expressão dos marcadores epitelial (citoqueratina) e mesenquimal (vimentina), juntamente com a redução da capacidade migratória das células tumorais 4T1, sugerem que o MEF2C tem um papel determinante nas propriedades invasoras das células tumorais, determinando a ocorrência parcial de transição epitelial-mesenquimal. De forma semelhante, a sobre-expressão do miR-194-5p também levou a uma redução da mobilidade das células tumorais 4T1, que, em conjunto com a mudança observada do fenótipo mesenquimal para o fenótipo epitelial, reflete um declínio no comportamento agressivo das células tumorais e reforça o papel do miR como supressor de tumores no cancro da mama triplo negativo. Em suma, ao perceber o contributo tanto do MEF2C como do miR-194-5p em cancro da mama triplo negativo, este estudo revela novos alvos passíveis de serem modulados em pacientes que sofrem deste subtipo de cancro da mama, de forma a tentar melhorar o seu prognóstico e, se possível, torná-lo livre de metástases.
Autores principais:	Caetano, Sara Cristina Barbosa
Assunto:	Epithelial-mesenchymal transition Invasiveness MEF2C miR-194-5p Triple negative breast cancer Teses de mestrado - 2022
Ano:	2022
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A nível global, o cancro mais diagnosticado em mulheres é o cancro da mama, tendo uma incidência de 2,3 milhões de novos casos por ano, o que levou à sua classificação como uma das principais causas de morte relacionada com o cancro. De entre os diversos subtipos de cancro da mama, o triplo negativo é considerado o subtipo mais agressivo, caracterizado por uma elevada propensão para desenvolver metástases, especialmente no parênquima encefálico. De facto, as metástases encefálicas de cancro da mama são um dos fatores que mais contribui para os elevados números de mortalidade em pacientes de cancro da mama, em muito devido à falta de terapias direcionadas e específicas para este subtipo. Durante o desenvolvimento de metástases, por um processo conhecido como a cascata metastática, as células tumorais sofrem alterações fenotípicas e morfológicas associadas sobretudo à ocorrência de um processo designado por transição epitelial-mesenquimal. Neste sentido, durante a transição epitelial-mesenquimal, as células tumorais perdem algumas das suas características epiteliais e adquirem um fenótipo parcial ou completamente mesenquimal, o que lhes confere propriedades de motilidade essenciais para processos invasivos que podem culminar na formação de metástases. No entanto, a complexidade que caracteriza a formação de metástases encefálicas de cancro da mama, especialmente derivadas do subtipo de cancro da mama triplo negativo, ainda é pouco compreendida. Por conseguinte, a descoberta de novas estratégias terapêuticas que consigam atuar na prevenção e mitigação das metástases de cancro da mama é necessária. Para tal, é imperativa a utilização de novos alvos passíveis de serem modulados e que visem prevenir ou atenuar o prognóstico associado à formação das metástases. Apesar das descobertas relativamente recentes no âmbito dos miRNAs e de proteínas oncogénicas, ainda há um longo caminho a percorrer para aumentar a sobrevivência global em pacientes com cancro da mama, especialmente aqueles que sofrem com a forma metastática de cancro da mama do subtipo triplo negativo. Estudos prévios realizados no nosso laboratório revelaram que o microRNA (miRNA ou miR)-194-5p está sub-expresso na corrente sanguínea numa fase inicial do desenvolvimento de metástases encefálicas de cancro da mama, o que aponta para que este miRNA possa ter um papel supressor no desenvolvimento de tumores. Através de uma análise bioinformática, foi também revelado que o fator de transcrição, conhecido como fator ativador do miócito 2C (MEF2C, do inglês myocyte enhancer factor 2C) é um alvo do miR-194-5p. Para além disso, a análise da expressão do MEF2C no parênquima encefálico, utilizando um modelo de ratinho da doença, demonstrou que este fator de transcrição tem uma expressão crescente ao longo do desenvolvimento de metástases encefálicas de cancro da mama. Adicionalmente, em amostras de pacientes com metástases encefálicas de cancro da mama, foi possível observar que com o aumento da severidade da doença, os níveis de MEF2C também incrementavam. Por estes motivos, tanto o miR-194-5p como o MEF2C surgem como novos intervenientes a serem estudados, com grande potencial para serem modulados e, desta forma, conseguir melhorar o prognóstico dos pacientes que sofrem de cancro da mama triplo negativo. Apesar da previsão in silico apontar para o MEF2C como um alvo do miR-194-5p, a causalidade entre a desregulação dos dois ainda não foi analisada até à data. Assim, este estudo pretende esclarecer o envolvimento tanto do MEF2C, tal como do miR-194-5p na tumorigénese, tentando estabelecer uma relação direta entre a sub-expressão deste miRNA e a sobre-expressão desta proteína. Adicionalmente, será determinante também perceber o papel do MEF2C e do miR-194-5p isoladamente nas propriedades metastáticas das células tumorais de cancro da mama. Uma linha celular de ratinho de cancro da mama triplo negativo (células 4T1) foi usada para as transfeções com um siRNA e um plasmídeo específicos para o MEF2C, ou com o pre-miR-194-5p, com o intuito de modular a expressão da proteína e do miRNA, respetivamente. As eficiências de modulação foram determinadas por real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) e por análise dos níveis de expressão do MEF2C e do miR-194-5p por imunofluorescência e por hibridização in situ, respetivamente. Em ambos os casos e após as modulações dos respetivos alvos, a viabilidade das células tumorais foi determinada pelo ensaio colorimétrico de MTT, enquanto as alterações fenotípicas das células foram avaliadas por imunofluorescência, analisando proteínas como a citoqueratina e a vimentina, marcadores epitelial e mesenquimal, respetivamente. Além disso, o comportamento migratório das células tumorais 4T1 foi seguido através da técnica de wound healing. Por último, o reflexo direto da modulação do miR-194-5p na expressão do MEF2C foi estudado recorrendo à análise dos níveis de mRNA e expressão proteica do MEF2C, através de RT-qPCR e análise de imunofluorescência respetivamente, ambos em células tumorais 4T1 a sobre-expressar o miR-194-5p. A modulação dos níveis de expressão do MEF2C foi conseguida com a transfeção de um siRNA e um plasmídeo, de forma a silenciar e sobre-expressar o MEF2C, respetivamente. O resultado do silenciamento do MEF2C foi confirmado pela redução significativa dos seus níveis de mRNA e da proteína. Apesar do aumento significativo dos níveis de mRNA do MEF2C, causado pelo plasmídeo, o mesmo não aconteceu com os seus níveis proteicos, uma vez que a eficiência de transfeção demonstrou ser consideravelmente baixa. Por esta razão, o plasmídeo usado para induzir a sobre-expressão do MEF2C foi excluído das restantes experiências em que se estudou o efeito desta proteína na tumorigénese das células de cancro da mama triplo negativo. Curiosamente, as células tumorais 4T1 que foram sujeitas ao silenciamento do MEF2C apresentaram uma diminuição na expressão tanto de vimentina como de citoqueratina, promovendo ainda uma perda significativa de capacidade migratória destas células. Por outro lado, o tratamento com o pre-miR-194-5p induziu um aumento dependente da dose na expressão do miRNA em células tumorais 4T1, embora com crescente toxicidade. Apesar da redução de viabilidade observada nas células tumorais tratadas com o pre-miR-194-5p a uma concentração de 30 nM, esta condição deverá ser estudada mais a fundo no futuro como uma possível opção terapêutica direcionada para as células tumorais de cancro da mama triplo negativo. A concentração não tóxica mais eficaz de pre-miR-194-5p (10 nM) foi selecionada e a sua expressão celular foi validada através de hibridização in situ, que mostrou novamente o aumento dos níveis celulares deste miR. Para além disso, a sobre-expressão do miR-194-5p promoveu ainda um aumento de citoqueratina e uma redução de vimentina, juntamente com uma diminuição significativa da capacidade migratória das células tumorais 4T1. Por fim, não foi possível estabelecer uma relação de causalidade entre o miR-194-5p e o MEF2C, uma vez que o aumento da expressão deste miR não induziu um efeito percetível nos níveis de mRNA nem proteicos do MEF2C. É importante realçar que com o intuito de perceber se o resultado anterior foi influenciado por algum mecanismo compensatório, foi feito um estudo adicional, a dois tempos diferentes (24 e 72 h). Ainda assim, não foi possível verificar a relação de causalidade entre o aumento da expressão do miR e o MEF2C. Coletivamente, os efeitos do silenciamento do MEF2C na expressão dos marcadores epitelial (citoqueratina) e mesenquimal (vimentina), juntamente com a redução da capacidade migratória das células tumorais 4T1, sugerem que o MEF2C tem um papel determinante nas propriedades invasoras das células tumorais, determinando a ocorrência parcial de transição epitelial-mesenquimal. De forma semelhante, a sobre-expressão do miR-194-5p também levou a uma redução da mobilidade das células tumorais 4T1, que, em conjunto com a mudança observada do fenótipo mesenquimal para o fenótipo epitelial, reflete um declínio no comportamento agressivo das células tumorais e reforça o papel do miR como supressor de tumores no cancro da mama triplo negativo. Em suma, ao perceber o contributo tanto do MEF2C como do miR-194-5p em cancro da mama triplo negativo, este estudo revela novos alvos passíveis de serem modulados em pacientes que sofrem deste subtipo de cancro da mama, de forma a tentar melhorar o seu prognóstico e, se possível, torná-lo livre de metástases.