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Survey of genomic features that putatively contribute to antimicrobial resistance in Chlamydia trachomatis

Detalhes bibliográficos
Resumo:	As infeções sexualmente transmissíveis (IST) abrangem um amplo conjunto de síndromes com quadros clínicos variados, sendo Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis e Treponema pallidum os principais responsáveis pelas IST curáveis. Entre estas, destaca-se C. trachomatis com uma estimativa de 129 milhões de novos casos por ano. C. trachomatis pode ser classificada em 15 principais genótipos (A – C, D – K, L1 – L3), com base no polimorfismo do gene ompA. Estes genótipos-ompA, geralmente, apresentam uma correlação com tropismo tecidular específico para diferentes tipos de mucosas, em vários locais anatómicos. As infeções por C. trachomatis podem ser tratadas facilmente com antibióticos, como azitromicina (classe dos macrólidos), doxiciclina (classe das tetraciclinas) e ainda fluoroquinolonas. No entanto, C. trachomatis pode ser detetada após tratamento antimicrobiano, algo que costuma ser relacionado com reinfeção ou falta de compromisso com o tratamento prescrito pelo médico. Contudo, a possibilidade de ocorrer resistência antimicrobiana (RAM) tem de ser considerada, devido à sua emergência em agentes etiológicos de outras IST, havendo assim necessidade de investigar a ocorrência deste fenómeno em C. trachomatis. Uma vez que o diagnóstico de rotina é efetuado por testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs), não é possível realizar ensaios fenotípicos para determinar a ocorrência de resistência aos antibióticos utilizados no tratamento das infeções por C. trachomatis. Deste modo, é necessário desenvolver e implementar sistemas moleculares que possibilitem obter informação sobre este fenómeno, de forma a que a determinação da potencial ocorrência de resistências possa ser efetuada ao nível do diagnóstico de rotina desta infeção. Na presente dissertação de mestrado, foi desenvolvida uma nova abordagem, baseada numa metodologia PCR Multiplex, tendo em vista a amplificação de genes-alvo potencialmente associados à ocorrência de resistência aos antibióticos em C. trachomatis (locus 23S rRNA, associado à resistência a macrólidos, genes gyrA e parC, associados à resistência a fluoroquinolonas). Neste sistema, para além dos genes potencialmente relacionados com RAM, foram também explorados genes que, em conjunto com o gene ompA, permitem realizar inferências relativas à filogenia e à estrutura genómica de C. trachomatis. Para este efeito, procedeu-se ao estudo do gene CT442, do gene pmpH e de uma região a montante do gene CT105. Para tal, foram estabelecidos critérios de seleção das estirpes a estudar, sendo a existência de amostra biológica que possibilitasse efetuar a cultura das estirpes (para eventual estudo fenotípico) o principal critério de prioridade. Procedeu-se à cultura de 251 estirpes, tendo sido recuperadas 119. Foram assim selecionadas 503 estirpes para o estudo, abrangendo os genótipos-ompA Da (n=24), E (n=9), F (n=4), G (n=10), J (n=5), L2 (n=297), L2b (n=139) e o genótipo-ompA recombinante L2b/Da (n=15). A amplificação dos 6 genes-alvo foi seguida por sequenciação de nova geração (NGS), usando a tecnologia Illumina, e análise bioinformática, de forma a pesquisar a ocorrência de mutações previamente reportadas nestas regiões. O número de sequências geradas por locus foi variável, tendo sido geradas 503 sequências para os loci 23S rRNA e gyrA, 216 para o gene parC, 189 para a região a montante do gene CT105, 337 para o gene pmpH e 247 para o gene CT442. De forma a aferir a existência de mutações que contribuam putativamente para a resistência a macrólidos, foram pesquisadas as mutações A2057G, A2058G e A2059G, no locus 23S rRNA. As mutações Ser83Ile e Arg83Gly também foram pesquisadas, nos genes gyrA e parC, respetivamente, de forma a aferir a existência de mutações que potencialmente contribuam para resistência a fluoroquinolonas. Relativamente aos loci relacionados com a estrutura genómica, foi pesquisada uma inserção de 74 pares de bases (pb), potencialmente específica de estirpes LGV, na região a montante do promotor do gene CT105. Também foi pesquisada uma inserção de 9 pb no gene pmpH, putativamente específica das estirpes L2b. Relativamente ao gene CT442, mutações pontuais nesta região permitiram a construção de uma árvore filogenética das estirpes clínicas analisadas. Após análise das sequências obtidas, não foram detetadas mutações associadas à resistência a macrólidos em qualquer das estirpes, tendo sido apenas identificadas 4 estirpes com mutações suscetíveis de promover resistência às fluoroquinolonas. Tais estirpes correspondiam a mutantes do genótipo L2b/Da (como já teria sido reportado) e L2, sendo que os resultados obtidos no presente trabalho constituem a primeira observação desta potencial resistência, neste genótipo. A presença destas mutações numa estirpe com genótipo-ompA L2 pode sugerir um aumento da circulação de estirpes potencialmente resistentes, e também a necessidade de desenvolver ensaios fenotípicos que afiram, de facto, a resistência às fluoroquinolonas nestas estirpes. A sequenciação da região a montante do gene CT105, permitiu verificar a elevada especificidade desta região na discriminação de estirpes LGV e não-LGV. Relativamente à inserção específica das estirpes L2b, localizada no gene pmpH, verificou-se que 96,02% das estirpes L2 apresentavam este marcador genético. A filogenia com base nas mutações do gene CT442 foi consistente com os resultados obtidos para os restantes loci, revelando uma vez mais que os genótipos-ompA nem sempre refletem a estrutura genómica das estirpes de C. trachomatis. Estes resultados sugerem que o sistema multiplex explorado na presente dissertação permitirá uma potencial maior robustez na determinação da estrutura genómica de C. trachomatis. Por outro lado, foram evidenciados padrões de recombinação que suscitam a necessidade de investigação futura, nomeadamente por sequenciação completa do genoma (WGS). Estes padrões de recombinação foram detetados em estirpes com potencial estrutura genómica de uma estirpe L2b que apresentam uma reversão para o genótipo-ompA L2 (mantendo as características clínicas de estirpes L2b). Este padrão de recombinação já foi reportado no passado, no contexto de um aumento dos casos de infeção por estirpes L2, no contexto da epidemia de estirpes L2b. Foi ainda detetada uma estirpe com genótipo-ompA não-LGV que nos restantes loci apresentava um perfil típico de uma estirpe LGV nos restantes loci, podendo potencialmente constituir um novo híbrido, tal como recentemente reportado em Portugal e noutros países. Em resumo, os resultados da presente dissertação permitiram identificar estirpes de C. trachomatis potencialmente resistentes às fluoroquinolonas em Portugal, assim como desenvolver um sistema PCR Multiplex aliado a NGS que melhor caracteriza as estirpes desta espécie em termos filogenéticos, para além de permitir detetar eventuais estirpes mutantes/recombinantes, o que sugere a sua utilização como um novo paradigma de classificação das estirpes de C. trachomatis com enorme interesse nos estudos de epidemiologia molecular.
Autores principais:	Silva, Jorge Luís Almeida Costa da
Assunto:	Chlamydia trachomatis Resistência antimicrobiana Genótipos-ompA PCR multiplex Sequenciação de Nova Geração Teses de mestrado - 2023
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	As infeções sexualmente transmissíveis (IST) abrangem um amplo conjunto de síndromes com quadros clínicos variados, sendo Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis e Treponema pallidum os principais responsáveis pelas IST curáveis. Entre estas, destaca-se C. trachomatis com uma estimativa de 129 milhões de novos casos por ano. C. trachomatis pode ser classificada em 15 principais genótipos (A – C, D – K, L1 – L3), com base no polimorfismo do gene ompA. Estes genótipos-ompA, geralmente, apresentam uma correlação com tropismo tecidular específico para diferentes tipos de mucosas, em vários locais anatómicos. As infeções por C. trachomatis podem ser tratadas facilmente com antibióticos, como azitromicina (classe dos macrólidos), doxiciclina (classe das tetraciclinas) e ainda fluoroquinolonas. No entanto, C. trachomatis pode ser detetada após tratamento antimicrobiano, algo que costuma ser relacionado com reinfeção ou falta de compromisso com o tratamento prescrito pelo médico. Contudo, a possibilidade de ocorrer resistência antimicrobiana (RAM) tem de ser considerada, devido à sua emergência em agentes etiológicos de outras IST, havendo assim necessidade de investigar a ocorrência deste fenómeno em C. trachomatis. Uma vez que o diagnóstico de rotina é efetuado por testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs), não é possível realizar ensaios fenotípicos para determinar a ocorrência de resistência aos antibióticos utilizados no tratamento das infeções por C. trachomatis. Deste modo, é necessário desenvolver e implementar sistemas moleculares que possibilitem obter informação sobre este fenómeno, de forma a que a determinação da potencial ocorrência de resistências possa ser efetuada ao nível do diagnóstico de rotina desta infeção. Na presente dissertação de mestrado, foi desenvolvida uma nova abordagem, baseada numa metodologia PCR Multiplex, tendo em vista a amplificação de genes-alvo potencialmente associados à ocorrência de resistência aos antibióticos em C. trachomatis (locus 23S rRNA, associado à resistência a macrólidos, genes gyrA e parC, associados à resistência a fluoroquinolonas). Neste sistema, para além dos genes potencialmente relacionados com RAM, foram também explorados genes que, em conjunto com o gene ompA, permitem realizar inferências relativas à filogenia e à estrutura genómica de C. trachomatis. Para este efeito, procedeu-se ao estudo do gene CT442, do gene pmpH e de uma região a montante do gene CT105. Para tal, foram estabelecidos critérios de seleção das estirpes a estudar, sendo a existência de amostra biológica que possibilitasse efetuar a cultura das estirpes (para eventual estudo fenotípico) o principal critério de prioridade. Procedeu-se à cultura de 251 estirpes, tendo sido recuperadas 119. Foram assim selecionadas 503 estirpes para o estudo, abrangendo os genótipos-ompA Da (n=24), E (n=9), F (n=4), G (n=10), J (n=5), L2 (n=297), L2b (n=139) e o genótipo-ompA recombinante L2b/Da (n=15). A amplificação dos 6 genes-alvo foi seguida por sequenciação de nova geração (NGS), usando a tecnologia Illumina, e análise bioinformática, de forma a pesquisar a ocorrência de mutações previamente reportadas nestas regiões. O número de sequências geradas por locus foi variável, tendo sido geradas 503 sequências para os loci 23S rRNA e gyrA, 216 para o gene parC, 189 para a região a montante do gene CT105, 337 para o gene pmpH e 247 para o gene CT442. De forma a aferir a existência de mutações que contribuam putativamente para a resistência a macrólidos, foram pesquisadas as mutações A2057G, A2058G e A2059G, no locus 23S rRNA. As mutações Ser83Ile e Arg83Gly também foram pesquisadas, nos genes gyrA e parC, respetivamente, de forma a aferir a existência de mutações que potencialmente contribuam para resistência a fluoroquinolonas. Relativamente aos loci relacionados com a estrutura genómica, foi pesquisada uma inserção de 74 pares de bases (pb), potencialmente específica de estirpes LGV, na região a montante do promotor do gene CT105. Também foi pesquisada uma inserção de 9 pb no gene pmpH, putativamente específica das estirpes L2b. Relativamente ao gene CT442, mutações pontuais nesta região permitiram a construção de uma árvore filogenética das estirpes clínicas analisadas. Após análise das sequências obtidas, não foram detetadas mutações associadas à resistência a macrólidos em qualquer das estirpes, tendo sido apenas identificadas 4 estirpes com mutações suscetíveis de promover resistência às fluoroquinolonas. Tais estirpes correspondiam a mutantes do genótipo L2b/Da (como já teria sido reportado) e L2, sendo que os resultados obtidos no presente trabalho constituem a primeira observação desta potencial resistência, neste genótipo. A presença destas mutações numa estirpe com genótipo-ompA L2 pode sugerir um aumento da circulação de estirpes potencialmente resistentes, e também a necessidade de desenvolver ensaios fenotípicos que afiram, de facto, a resistência às fluoroquinolonas nestas estirpes. A sequenciação da região a montante do gene CT105, permitiu verificar a elevada especificidade desta região na discriminação de estirpes LGV e não-LGV. Relativamente à inserção específica das estirpes L2b, localizada no gene pmpH, verificou-se que 96,02% das estirpes L2 apresentavam este marcador genético. A filogenia com base nas mutações do gene CT442 foi consistente com os resultados obtidos para os restantes loci, revelando uma vez mais que os genótipos-ompA nem sempre refletem a estrutura genómica das estirpes de C. trachomatis. Estes resultados sugerem que o sistema multiplex explorado na presente dissertação permitirá uma potencial maior robustez na determinação da estrutura genómica de C. trachomatis. Por outro lado, foram evidenciados padrões de recombinação que suscitam a necessidade de investigação futura, nomeadamente por sequenciação completa do genoma (WGS). Estes padrões de recombinação foram detetados em estirpes com potencial estrutura genómica de uma estirpe L2b que apresentam uma reversão para o genótipo-ompA L2 (mantendo as características clínicas de estirpes L2b). Este padrão de recombinação já foi reportado no passado, no contexto de um aumento dos casos de infeção por estirpes L2, no contexto da epidemia de estirpes L2b. Foi ainda detetada uma estirpe com genótipo-ompA não-LGV que nos restantes loci apresentava um perfil típico de uma estirpe LGV nos restantes loci, podendo potencialmente constituir um novo híbrido, tal como recentemente reportado em Portugal e noutros países. Em resumo, os resultados da presente dissertação permitiram identificar estirpes de C. trachomatis potencialmente resistentes às fluoroquinolonas em Portugal, assim como desenvolver um sistema PCR Multiplex aliado a NGS que melhor caracteriza as estirpes desta espécie em termos filogenéticos, para além de permitir detetar eventuais estirpes mutantes/recombinantes, o que sugere a sua utilização como um novo paradigma de classificação das estirpes de C. trachomatis com enorme interesse nos estudos de epidemiologia molecular.