Publicação

Determining the effect of olfactory receptors on the survival to Pseudomonas entomophila infection in Drosophila melanogaster

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O estudo do ciclo das relações entre patógeno e hospedeiro sempre foi importante para embasar o conhecimento dos mecanismos imunes por detrás do combate a doenças. A resposta imune inata, presente em ambos vertebrados e invertebrados, é a mais primordial e não depende de uma memória imune, ao contrário da resposta imune adaptativa, que apenas existe em vertebrados. Drosophila melanogaster, ao ter apenas o primeiro tipo de resposta imune citado, permite-nos isolar o sistema imune inato, facilitando o estudo do mesmo. Em Drosophila temos quatro tipos principais de resposta imune: comportamental, em que o indivíduo fisicamente reage de várias formas para evitar a infeção; barreiras epiteliais, que ajudam a travar a entrada do patógeno para dentro do organismo; imunidade humoral que consiste na produção de péptidos anti microbianos; e imunidade celular que assenta na ação dos hemócitos, as células do sangue produzidas no estádio larvar que perduram até ao adulto. Além do sistema imune, também o sistema olfativo participa na reação às ameaças de potenciais patógenos. Normalmente este sistema medeia as alterações comportamentais que levam ao evitar da infeção. No entanto, mais recentemente, estudos têm provado que este sistema pode também interagir de forma direta com os processos imunitários. Concretamente, ao detetar certos estímulos olfativos, este sistema consegue sinalizar às células imunitárias a ameaça gerando um boost imunitário no hospedeiro. No entanto, o conhecimento sobre o real papel deste sistema na imunidade e seus mecanismos é ainda quase completamente desconhecido. No adulto de Drosophila existem duas estruturas principais onde ocorre a olfação: a antena e os palpos maxilares. Estas estruturas são cobertas por vários elementos porosos denominados de sensilas e é neles que se encontram os neurónios recetores olfativos. Estes neurónios estão cobertos por recetores olfativos que detetam moléculas designadas por odorantes. Para serem funcionais, os recetores olfativos estão acoplados a um co-recetor estável chamado de ORCO. Nesta tese investigámos o possível efeito destes recetores olfativos durante a resposta imune. Para tal, recorrendo à tecnologia de RNAi sob o controlo do sistema UAS/Gal4/Gal80 por forma a não afetar o desenvolvimento dos indivíduos até ao estágio adulto, no qual se testou a atividade de 43 recetores olfativos. Para inferir a resposta imune das diferentes linhas, infetámos moscas de ambos os sexos com Pseudomonas entomophila, uma bactéria patogénica gram-negativa, e medimos a sobrevivência. Verificámos que ocorreu uma variação significativa nas curvas de sobrevivência, com uma grande amplitude tanto em machos quanto em fêmeas. Esses resultados mostram que a falta de expressão dos genes influencia a resposta do sistema imune nestes indivíduos com consequências no fitness das moscas. Com base nos resultados obtidos, especulamos que a causa desta variação poderá ser uma maior ou menor expressão de péptidos antimicrobianos. Esta hipótese tem sido verificada em outros mecanismos imunes, inclusive num estudo que foca em recetores olfativos e neurónios recetores olfativos. Outra hipótese seria o mecanismo de RNAi em si, já que foi provado que a temperatura afeta a expressão dos recetores olfativos, fazendo com que o mecanismo seja mais efetivo em genes sub-expressos do que em genes sobre-expressos. Uma vez que tínhamos as curvas de sobrevivência em ambos machos e fêmeas, tentámos compreender se existia algum dimorfismo sexual na resposta imune. De facto, esse dimorfismo pôde ser encontrado em algumas das linhas estudadas. A principal interpretação biológica por detrás deste resultado seria uma imunidade específica do sexo, que é plenamente aceite pela sociedade científica em várias outras situações. Outras possíveis interpretações seriam um impacto específico do sexo no sistema RNAi, o que já foi provado que ocorre em alguns genes relacionados com a determinação sexual. Outra hipótese seria algo ao nível do sexo conferir uma expressão diferenciada aos genes, como no caso do recetor olfativo responsável por detetar hormonas de cortejamento, ou até mesmo o comportamento social diferencial entre machos e fêmeas. Ainda com os dados de sobrevivência, através de uma análise de clustering, foi possível isolar as linhas com o comportamento mais divergente em machos e fêmeas. Curiosamente, o co-recetor ORCO foi selecionado como sendo uma linha divergente em machos. Também relevante, as linhas selecionadas em machos e fêmeas, são, na sua grande maioria, diferentes. Uma vez que conseguimos isolar as linhas mais divergentes decidimos medir o output reprodutivo em fêmeas. Esta experiência ocorreu de forma semelhante à primeira, onde infetámos moscas com P. entomophila, no entanto, após a infeção além de medirmos a mortalidade, medimos também o número de pupas em cada tubo. Observámos que havia uma grande variação no output em todas as linhas. Além disso, verificámos que na maior parte das linhas a maior pupação ocorreu nos dias 7 e 8, podendo indicar algum tipo de mecanismo de sobrevivência, como por exemplo, a diminuição da oviposição durante os primeiros estádios da infeção. Com isto, ao tentar inferir possíveis trade-offs que tenham ocorrido durante a infeção nas linhas divergentes, elaborámos algumas hipóteses. Primeiramente, a hipótese de ser devido a conservar energia para combater a infeção, como explicado acima, a oviposição seria reduzida durante o início da infeção para conservar energia, aumentando uma vez que a infeção estivesse controlada. Em segundo lugar seria a hipótese de que linhas com menor sobrevivência teriam mais dificuldade em detetar o patógeno do que as restantes linhas, fazendo com que consumissem mais bactéria, levando a uma maior concentração da mesma no corpo, dificultando o combate à infeção. Finalmente, poderá ser que as moscas com menor mortalidade tenham simplesmente um melhor sistema imune, combatendo a infeção mais rapidamente, conseguindo pôr mais ovos. Por fim, traçámos uma correlação de Pearson entre fecundidade e mortalidade. Surpreendentemente, os resultados mostram que não existe correlação entre elas. Resumindo, nesta tese de mestrado tentámos entender qual os efeitos do olfato na resposta imune em Drosophila melanogaster. Concluímos que diferentes linhas de recetores olfativos sem expressão sobrevivem de forma diferente à infeção de Pseudomonas entomophila e que existe dimorfismo sexual em algumas destas linhas. Pudemos ainda isolar as linhas com uma resposta mais divergente e medir o output reprodutivo destas linhas, em fêmeas. Finalmente, cruzámos os resultados de sobrevivência com os resultados de output reprodutivo e verificámos que não existe qualquer correlação entre os mesmos. Os resultados aqui obtidos mostram que existe ainda muito a estudar no que toca à função do olfato na imunidade. Esta tese procurou elucidar aquilo que é conhecido em relação à função dos recetores olfativos no sistema imune, no entanto, ainda existem muitas lacunas que espero serão preenchidas ao longo dos próximos anos.
Autores principais:	Antunes, Margarida Botelho
Assunto:	Drosophila melanogaster Imunidade Pseudomonas entomophila Output reprodutivo Olfato Teses de mestrado - 2025
Ano:	2025
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O estudo do ciclo das relações entre patógeno e hospedeiro sempre foi importante para embasar o conhecimento dos mecanismos imunes por detrás do combate a doenças. A resposta imune inata, presente em ambos vertebrados e invertebrados, é a mais primordial e não depende de uma memória imune, ao contrário da resposta imune adaptativa, que apenas existe em vertebrados. Drosophila melanogaster, ao ter apenas o primeiro tipo de resposta imune citado, permite-nos isolar o sistema imune inato, facilitando o estudo do mesmo. Em Drosophila temos quatro tipos principais de resposta imune: comportamental, em que o indivíduo fisicamente reage de várias formas para evitar a infeção; barreiras epiteliais, que ajudam a travar a entrada do patógeno para dentro do organismo; imunidade humoral que consiste na produção de péptidos anti microbianos; e imunidade celular que assenta na ação dos hemócitos, as células do sangue produzidas no estádio larvar que perduram até ao adulto. Além do sistema imune, também o sistema olfativo participa na reação às ameaças de potenciais patógenos. Normalmente este sistema medeia as alterações comportamentais que levam ao evitar da infeção. No entanto, mais recentemente, estudos têm provado que este sistema pode também interagir de forma direta com os processos imunitários. Concretamente, ao detetar certos estímulos olfativos, este sistema consegue sinalizar às células imunitárias a ameaça gerando um boost imunitário no hospedeiro. No entanto, o conhecimento sobre o real papel deste sistema na imunidade e seus mecanismos é ainda quase completamente desconhecido. No adulto de Drosophila existem duas estruturas principais onde ocorre a olfação: a antena e os palpos maxilares. Estas estruturas são cobertas por vários elementos porosos denominados de sensilas e é neles que se encontram os neurónios recetores olfativos. Estes neurónios estão cobertos por recetores olfativos que detetam moléculas designadas por odorantes. Para serem funcionais, os recetores olfativos estão acoplados a um co-recetor estável chamado de ORCO. Nesta tese investigámos o possível efeito destes recetores olfativos durante a resposta imune. Para tal, recorrendo à tecnologia de RNAi sob o controlo do sistema UAS/Gal4/Gal80 por forma a não afetar o desenvolvimento dos indivíduos até ao estágio adulto, no qual se testou a atividade de 43 recetores olfativos. Para inferir a resposta imune das diferentes linhas, infetámos moscas de ambos os sexos com Pseudomonas entomophila, uma bactéria patogénica gram-negativa, e medimos a sobrevivência. Verificámos que ocorreu uma variação significativa nas curvas de sobrevivência, com uma grande amplitude tanto em machos quanto em fêmeas. Esses resultados mostram que a falta de expressão dos genes influencia a resposta do sistema imune nestes indivíduos com consequências no fitness das moscas. Com base nos resultados obtidos, especulamos que a causa desta variação poderá ser uma maior ou menor expressão de péptidos antimicrobianos. Esta hipótese tem sido verificada em outros mecanismos imunes, inclusive num estudo que foca em recetores olfativos e neurónios recetores olfativos. Outra hipótese seria o mecanismo de RNAi em si, já que foi provado que a temperatura afeta a expressão dos recetores olfativos, fazendo com que o mecanismo seja mais efetivo em genes sub-expressos do que em genes sobre-expressos. Uma vez que tínhamos as curvas de sobrevivência em ambos machos e fêmeas, tentámos compreender se existia algum dimorfismo sexual na resposta imune. De facto, esse dimorfismo pôde ser encontrado em algumas das linhas estudadas. A principal interpretação biológica por detrás deste resultado seria uma imunidade específica do sexo, que é plenamente aceite pela sociedade científica em várias outras situações. Outras possíveis interpretações seriam um impacto específico do sexo no sistema RNAi, o que já foi provado que ocorre em alguns genes relacionados com a determinação sexual. Outra hipótese seria algo ao nível do sexo conferir uma expressão diferenciada aos genes, como no caso do recetor olfativo responsável por detetar hormonas de cortejamento, ou até mesmo o comportamento social diferencial entre machos e fêmeas. Ainda com os dados de sobrevivência, através de uma análise de clustering, foi possível isolar as linhas com o comportamento mais divergente em machos e fêmeas. Curiosamente, o co-recetor ORCO foi selecionado como sendo uma linha divergente em machos. Também relevante, as linhas selecionadas em machos e fêmeas, são, na sua grande maioria, diferentes. Uma vez que conseguimos isolar as linhas mais divergentes decidimos medir o output reprodutivo em fêmeas. Esta experiência ocorreu de forma semelhante à primeira, onde infetámos moscas com P. entomophila, no entanto, após a infeção além de medirmos a mortalidade, medimos também o número de pupas em cada tubo. Observámos que havia uma grande variação no output em todas as linhas. Além disso, verificámos que na maior parte das linhas a maior pupação ocorreu nos dias 7 e 8, podendo indicar algum tipo de mecanismo de sobrevivência, como por exemplo, a diminuição da oviposição durante os primeiros estádios da infeção. Com isto, ao tentar inferir possíveis trade-offs que tenham ocorrido durante a infeção nas linhas divergentes, elaborámos algumas hipóteses. Primeiramente, a hipótese de ser devido a conservar energia para combater a infeção, como explicado acima, a oviposição seria reduzida durante o início da infeção para conservar energia, aumentando uma vez que a infeção estivesse controlada. Em segundo lugar seria a hipótese de que linhas com menor sobrevivência teriam mais dificuldade em detetar o patógeno do que as restantes linhas, fazendo com que consumissem mais bactéria, levando a uma maior concentração da mesma no corpo, dificultando o combate à infeção. Finalmente, poderá ser que as moscas com menor mortalidade tenham simplesmente um melhor sistema imune, combatendo a infeção mais rapidamente, conseguindo pôr mais ovos. Por fim, traçámos uma correlação de Pearson entre fecundidade e mortalidade. Surpreendentemente, os resultados mostram que não existe correlação entre elas. Resumindo, nesta tese de mestrado tentámos entender qual os efeitos do olfato na resposta imune em Drosophila melanogaster. Concluímos que diferentes linhas de recetores olfativos sem expressão sobrevivem de forma diferente à infeção de Pseudomonas entomophila e que existe dimorfismo sexual em algumas destas linhas. Pudemos ainda isolar as linhas com uma resposta mais divergente e medir o output reprodutivo destas linhas, em fêmeas. Finalmente, cruzámos os resultados de sobrevivência com os resultados de output reprodutivo e verificámos que não existe qualquer correlação entre os mesmos. Os resultados aqui obtidos mostram que existe ainda muito a estudar no que toca à função do olfato na imunidade. Esta tese procurou elucidar aquilo que é conhecido em relação à função dos recetores olfativos no sistema imune, no entanto, ainda existem muitas lacunas que espero serão preenchidas ao longo dos próximos anos.