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A new variant in the interleukin-6 receptor (IL-6R) gene increases gene expression and asthma risk

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A interleucina-6 (IL-6) é uma citocina envolvida na asma alérgica, que atua nas suas células-alvo através de um recetor constituído por pelo menos duas subunidades membranares: uma glicoproteína de associação ao ligando (IL-6R) e uma glicoproteína transdutora de sinal (gp130). Embora a gp130 se expresse na grande maioria das células, apenas algumas são diretamente estimuladas pela IL-6, porque a expressão da IL-6R membranar (mIL-6R) é limitada a hepatócitos e determinadas células imunes. No entanto, a IL-6R também existe sob forma solúvel (sIL-6R), que tanto pode ser formada por clivagem da mIL-6R, como por splicing alternativo. Uma vez ligada à IL-6, a sIL-6R pode associar-se à gp130, estimulando as células por uma via alternativa, também viável em células que não expressam mIL-6R. A variante rs2228145, no gene IL6R, encontra-se na região que codifica para o local de corte da mIL-6R e é considerada o principal determinante genético dos níveis de sIL-6R, representando cerca de 19% da sua variabilidade. Portadores do alelo de risco têm elevados níveis de sIL-6R e maior risco de asma. No entanto, a percentagem de variação nos níveis de sIL-6R explicada geneticamente é estimada em 70%, muito superior aos 19% supramencionados, pelo que é possível que outras variantes no IL6R, ou próximo deste, também contribuam para a sua variabilidade independentemente da rs2228145, e possivelmente afetem o risco de asma. Para testar esta hipótese, neste estudo (1) efetuámos uma imputação exaustiva de variantes comuns na região do IL6R; (2) testámos a associação entre as variantes obtidas e os níveis de sIL-6R de 360 indivíduos; (3) replicámos o estudo numa amostra independente de 354 indivíduos para as variantes que apresentaram associação mais forte; e (4) testámos a associação das variantes replicadas (a) com os níveis de transcrito do IL6R (em dois estudos independentes; N = 851 e N = 5 191) e (b) com o risco de asma (N = 47 514). Segue-se uma descrição mais pormenorizada de todos estes pontos. Numa primeira fase, medimos em duplicado as concentrações serológicas de sIL-6R de 360 asmáticos já genotipados. Após eliminar variabilidades técnicas, calculámos a média dos níveis corrigidos de sIL-6R para cada indivíduo e normalizámos a distribuição global das medições. Não se verificaram efeitos significativos do sexo ou da idade. Tendo o 1000 Genomes Project como referência, imputámos 452 variantes no IL6R (± 50 kb) dos 360 asmáticos, e testámos a sua associação com os níveis de sIL-6R, bem como a de outras 19 variantes diretamente genotipadas nestes indivíduos. A variante que apresentou maior grau de associação (P = 0.0005) com os níveis de sIL-6R ajustados pelo rs4129267, uma variante correlacionada (r2 = 0.99) com a rs2228145, foi a rs12083537, e a associação manteve-se significativa (P = 0.0496) após correção pelo número de variantes testadas. Três variantes independentes demonstraram estar significativamente associadas com os níveis de sIL-6R ajustados pelas variantes rs4129267 e rs12083537, mas qualquer destas associações deixou de ser significativa depois de corrigir pelo número de variantes testadas. Para confirmar a associação entre a variante rs12083537 e os níveis de sIL-6R, replicámos o estudo de associação em 354 indivíduos não relacionados com os anteriores. Após ajustamento pelos efeitos do rs4129267, detetámos uma associação significativa entre o rs12083537 e os níveis de sIL-6R (P = 0.033), sendo a direção do efeito a mesma que a da análise prévia. Estes resultados confirmam portanto que rs12083537, ou uma variante correlacionada com esta, regula os níveis serológicos de sIL-6R. Depois de combinar as duas amostras onde se efetuaram os estudos de associação (N = 714), o rs12083537 passou a explicar 2.2% da variabilidade dos níveis de sIL-6R ajustados pelo rs4129267 (P = 6x10-5), sendo que antes do ajuste explicava 0.15%. O alelo rs12083537:G reduziu os níveis de sIL-6R de forma semelhante nas três classes genotípicas do rs4129267. Para ajudar a compreender o mecanismo molecular pelo qual o rs12083537 afeta os níveis de sIL-6R, estudámos em seguida os níveis de RNA mensageiro (mRNA) do IL6R num grupo de gémeos adolescentes (N = 851) para determinar se esta variante influenciava os níveis da transcrição. Não foi detetada associação significativa entre o rs12083537 e os níveis de mRNA, quer com uma sonda para a região 3’UTR, quer com uma sonda para o exão 9. Por outro lado, detetámos uma associação significativa entre a variante rs4129267 e os níveis de transcrito do IL6R. Contraintuitivamente, o alelo rs4129267:T, que aumenta os níveis de sIL- 6R, demonstrou associação com baixos níveis de transcrito do IL6R. Para garantir que a ausência de associação entre o rs12083537 e os níveis de mRNA do IL6R não se deveu a baixo poder de deteção da nossa amostra, realizámos uma análise semelhante à anterior num estudo independente e maior (N = 5 191). Neste estudo, após correção pelo número de sondas testadas, não foi detetada uma associação significativa entre a variante e os níveis de mRNA do IL6R. A sonda para a qual a associação foi mais forte é complementar à região 3’UTR (P = 0.0031); o alelo rs12083537:A que aumenta os níveis de sIL-6R esteve associado com uma redução dos níveis de transcrito do IL6R. Por fim, como o alelo rs2228145:C aumenta não só os níveis de sIL-6R mas também o risco de asma, testámos a hipótese de o rs12083537 também ser um fator genético de risco para a asma. A associação entre esta variante e asma foi testada em 47 514 indivíduos de três estudos independentes, dos quais 16 705 eram asmáticos diagnosticados por um médico. O alelo rs12083537:A foi detetado com mais frequência em asmáticos do que nao-asmáticos nos três estudos individuais, sendo a associação global entre o rs12083537 e o risco de asma fraca mas estatisticamente significativa (OR = 1.039, 95% I.C. = 1.002 – 1.078, P = 0.0419). A variante rs12083537 localizada no intrão 1 do IL6R, a 2.9 kb do exão 1, revelou estar significativamente associada com os níveis de sIL-6R independentemente da variante rs4129267, e a associação foi confirmada quando replicámos a análise. A variante localiza-se numa região do gene que, em pelo menos quatro linhas celulares, incluindo fibroblastos pulmonares e queratinócitos, tem elevado grau de metilação (H3K4Me1). Este tipo de modificação de histonas está associada a enhancers e promotores, sendo portanto plausível que o rs12083537 influencie a transcrição do IL6R. No entanto, não foi detetada associação significativa entre o rs12083537 e os níveis de mRNA do IL6R, pelo que o mecanismo de ação da variante permanece por elucidar. Também verificámos que o alelo rs4129267:T, que aumenta os níveis de sIL-6R, está associado a baixos níveis de mRNA do IL6R. As medições para as quais se verificou esta associação foram feitas com uma sonda que se liga ao exão 9, o qual pode ser removido por splicing alternativo. Assim, as medições em causa correspondem apenas aos níveis de mRNA que não sofreu splicing. Tendo em conta que o alelo rs4129267:T está associado a um aumento do splicing do exão 9, é portanto de esperar que os níveis da isoforma que não sofreu splicing diminuam na presença deste alelo. Por fim, verificámos que a variante rs12083537 está significativamente associada com o risco de asma. Com base na nossa análise, cada alelo rs12083537:A aumenta os níveis serológicos de sIL-6R cerca de 2.4 vezes e o risco de asma1.04 vezes. Em conclusão, este estudo demonstra que pelo menos duas variantes genéticas influenciam os níveis serológicos de sIL-6R. Como tal, estudos de resposta clínica ao tocilizumab, um anticorpo monoclonal para o IL-6R já aprovado para o tratamento da artrite reumatoide, devem avaliar a contribuição das diversas variantes que regulam os níveis de sIL-6R. Pontuações de risco genético cumulativo poderão ser úteis para explicar variabilidade na respostas clínica ao tocilizumab.
Autores principais:	Revez, Joana Nunes Mexia Allen, 1989-
Assunto:	Biologia molecular Asma alérgica Teses de mestrado - 2013
Ano:	2013
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A interleucina-6 (IL-6) é uma citocina envolvida na asma alérgica, que atua nas suas células-alvo através de um recetor constituído por pelo menos duas subunidades membranares: uma glicoproteína de associação ao ligando (IL-6R) e uma glicoproteína transdutora de sinal (gp130). Embora a gp130 se expresse na grande maioria das células, apenas algumas são diretamente estimuladas pela IL-6, porque a expressão da IL-6R membranar (mIL-6R) é limitada a hepatócitos e determinadas células imunes. No entanto, a IL-6R também existe sob forma solúvel (sIL-6R), que tanto pode ser formada por clivagem da mIL-6R, como por splicing alternativo. Uma vez ligada à IL-6, a sIL-6R pode associar-se à gp130, estimulando as células por uma via alternativa, também viável em células que não expressam mIL-6R. A variante rs2228145, no gene IL6R, encontra-se na região que codifica para o local de corte da mIL-6R e é considerada o principal determinante genético dos níveis de sIL-6R, representando cerca de 19% da sua variabilidade. Portadores do alelo de risco têm elevados níveis de sIL-6R e maior risco de asma. No entanto, a percentagem de variação nos níveis de sIL-6R explicada geneticamente é estimada em 70%, muito superior aos 19% supramencionados, pelo que é possível que outras variantes no IL6R, ou próximo deste, também contribuam para a sua variabilidade independentemente da rs2228145, e possivelmente afetem o risco de asma. Para testar esta hipótese, neste estudo (1) efetuámos uma imputação exaustiva de variantes comuns na região do IL6R; (2) testámos a associação entre as variantes obtidas e os níveis de sIL-6R de 360 indivíduos; (3) replicámos o estudo numa amostra independente de 354 indivíduos para as variantes que apresentaram associação mais forte; e (4) testámos a associação das variantes replicadas (a) com os níveis de transcrito do IL6R (em dois estudos independentes; N = 851 e N = 5 191) e (b) com o risco de asma (N = 47 514). Segue-se uma descrição mais pormenorizada de todos estes pontos. Numa primeira fase, medimos em duplicado as concentrações serológicas de sIL-6R de 360 asmáticos já genotipados. Após eliminar variabilidades técnicas, calculámos a média dos níveis corrigidos de sIL-6R para cada indivíduo e normalizámos a distribuição global das medições. Não se verificaram efeitos significativos do sexo ou da idade. Tendo o 1000 Genomes Project como referência, imputámos 452 variantes no IL6R (± 50 kb) dos 360 asmáticos, e testámos a sua associação com os níveis de sIL-6R, bem como a de outras 19 variantes diretamente genotipadas nestes indivíduos. A variante que apresentou maior grau de associação (P = 0.0005) com os níveis de sIL-6R ajustados pelo rs4129267, uma variante correlacionada (r2 = 0.99) com a rs2228145, foi a rs12083537, e a associação manteve-se significativa (P = 0.0496) após correção pelo número de variantes testadas. Três variantes independentes demonstraram estar significativamente associadas com os níveis de sIL-6R ajustados pelas variantes rs4129267 e rs12083537, mas qualquer destas associações deixou de ser significativa depois de corrigir pelo número de variantes testadas. Para confirmar a associação entre a variante rs12083537 e os níveis de sIL-6R, replicámos o estudo de associação em 354 indivíduos não relacionados com os anteriores. Após ajustamento pelos efeitos do rs4129267, detetámos uma associação significativa entre o rs12083537 e os níveis de sIL-6R (P = 0.033), sendo a direção do efeito a mesma que a da análise prévia. Estes resultados confirmam portanto que rs12083537, ou uma variante correlacionada com esta, regula os níveis serológicos de sIL-6R. Depois de combinar as duas amostras onde se efetuaram os estudos de associação (N = 714), o rs12083537 passou a explicar 2.2% da variabilidade dos níveis de sIL-6R ajustados pelo rs4129267 (P = 6x10-5), sendo que antes do ajuste explicava 0.15%. O alelo rs12083537:G reduziu os níveis de sIL-6R de forma semelhante nas três classes genotípicas do rs4129267. Para ajudar a compreender o mecanismo molecular pelo qual o rs12083537 afeta os níveis de sIL-6R, estudámos em seguida os níveis de RNA mensageiro (mRNA) do IL6R num grupo de gémeos adolescentes (N = 851) para determinar se esta variante influenciava os níveis da transcrição. Não foi detetada associação significativa entre o rs12083537 e os níveis de mRNA, quer com uma sonda para a região 3’UTR, quer com uma sonda para o exão 9. Por outro lado, detetámos uma associação significativa entre a variante rs4129267 e os níveis de transcrito do IL6R. Contraintuitivamente, o alelo rs4129267:T, que aumenta os níveis de sIL- 6R, demonstrou associação com baixos níveis de transcrito do IL6R. Para garantir que a ausência de associação entre o rs12083537 e os níveis de mRNA do IL6R não se deveu a baixo poder de deteção da nossa amostra, realizámos uma análise semelhante à anterior num estudo independente e maior (N = 5 191). Neste estudo, após correção pelo número de sondas testadas, não foi detetada uma associação significativa entre a variante e os níveis de mRNA do IL6R. A sonda para a qual a associação foi mais forte é complementar à região 3’UTR (P = 0.0031); o alelo rs12083537:A que aumenta os níveis de sIL-6R esteve associado com uma redução dos níveis de transcrito do IL6R. Por fim, como o alelo rs2228145:C aumenta não só os níveis de sIL-6R mas também o risco de asma, testámos a hipótese de o rs12083537 também ser um fator genético de risco para a asma. A associação entre esta variante e asma foi testada em 47 514 indivíduos de três estudos independentes, dos quais 16 705 eram asmáticos diagnosticados por um médico. O alelo rs12083537:A foi detetado com mais frequência em asmáticos do que nao-asmáticos nos três estudos individuais, sendo a associação global entre o rs12083537 e o risco de asma fraca mas estatisticamente significativa (OR = 1.039, 95% I.C. = 1.002 – 1.078, P = 0.0419). A variante rs12083537 localizada no intrão 1 do IL6R, a 2.9 kb do exão 1, revelou estar significativamente associada com os níveis de sIL-6R independentemente da variante rs4129267, e a associação foi confirmada quando replicámos a análise. A variante localiza-se numa região do gene que, em pelo menos quatro linhas celulares, incluindo fibroblastos pulmonares e queratinócitos, tem elevado grau de metilação (H3K4Me1). Este tipo de modificação de histonas está associada a enhancers e promotores, sendo portanto plausível que o rs12083537 influencie a transcrição do IL6R. No entanto, não foi detetada associação significativa entre o rs12083537 e os níveis de mRNA do IL6R, pelo que o mecanismo de ação da variante permanece por elucidar. Também verificámos que o alelo rs4129267:T, que aumenta os níveis de sIL-6R, está associado a baixos níveis de mRNA do IL6R. As medições para as quais se verificou esta associação foram feitas com uma sonda que se liga ao exão 9, o qual pode ser removido por splicing alternativo. Assim, as medições em causa correspondem apenas aos níveis de mRNA que não sofreu splicing. Tendo em conta que o alelo rs4129267:T está associado a um aumento do splicing do exão 9, é portanto de esperar que os níveis da isoforma que não sofreu splicing diminuam na presença deste alelo. Por fim, verificámos que a variante rs12083537 está significativamente associada com o risco de asma. Com base na nossa análise, cada alelo rs12083537:A aumenta os níveis serológicos de sIL-6R cerca de 2.4 vezes e o risco de asma1.04 vezes. Em conclusão, este estudo demonstra que pelo menos duas variantes genéticas influenciam os níveis serológicos de sIL-6R. Como tal, estudos de resposta clínica ao tocilizumab, um anticorpo monoclonal para o IL-6R já aprovado para o tratamento da artrite reumatoide, devem avaliar a contribuição das diversas variantes que regulam os níveis de sIL-6R. Pontuações de risco genético cumulativo poderão ser úteis para explicar variabilidade na respostas clínica ao tocilizumab.