Publicação

Development of an immunotoxin for breast cancer treatment

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O cancro continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo, sendo o cancro de mama o segundo tipo de cancro mais comum em todo o mundo. Cerca de uma em cada oito mulheres são diagnosticadas todos os anos. Em 2018, registaram-se perto de 2 milhões de novos casos de cancro de mama e ocorreram cerca de 630000 mortes derivadas à doença. Estima-se que este número aumente e que em 2025 se registem aproximadamente 2,5 milhões novos casos. O subtipo de cancro de mama Human Epidermal growth factor Receptor-type 2 (HER2) positivo é um dos mais agressivos e o recetor 2 do fator de crescimento epidérmico humano é um dos alvos mais explorados para o desenvolvimento de novas classes de anticorpos monoclonais e imunoterapias. O recetor HER2 encontra encontra-se expresso numa grande variedade de tumores e a sua sobre-expressão pode promover tumorigenese celular, fazendo com que células normais se tornem potenciais células cancerígenas. As terapias convencionais atuais no tratamento do cancro da mama apresentam bastantes objeções à sua utilização - a intervenção cirúrgica pode levar ao reaparecimento do tumor, devido à possibilidade de metástases locais; as doses necessárias para a quimioterapia são muito elevadas; a pouca especificidade no tratamento, dado que este também atua em células saudáveis do paciente; a existência de células resistentes a fármacos químicos e, por fim, a possibilidade de ocorrer a rádio resistência que é a resposta à reparação ao dano no ADN. Devido a todas estas adversidades, surgiu a imunoterapia que induz uma resposta imunitária contra o cancro e, mais recentemente, as terapias direcionadas que atuam não induzindo uma resposta imunológica como as imunoterapias, mas, sim, que direcionam fármacos ou toxinas ao alvo/antigénio desejado, sendo estas de vários tipos como os anticorpos monoclonais e os imunoconjugados, por exemplo. Estas moléculas são compostas por dois componentes, um anticorpo direcionado e específico para o alvo e, ligado a este, uma molécula citotóxica que mata as células cancerígenas. No entanto, apesar deste grande avanço, ainda existem obstáculos à utilização destas terapias contra o cancro - as resistências; a heterogeneidade tumoral; o acesso limitado às terapias; a falta de previsão na resposta imunitária do paciente e o elevado custo de produção, que limita a capacidade do seu desenvolvimento, levando a um aumento dos custos da terapia. Tanto os imunoconjugados como até mesmo o Trastuzumab (anticorpo monoclonal) usados na imunoterapia e nas terapias direcionadas que utilizam um anticorpo no seu tamanho convencional com reduzida penetração tumoral, impulsionou a grande procura para o desenvolvimento de formatos mais pequenos de anticorpos de domínio único (sdAbs). Os sdAb VL apresentam vantagens - melhor acesso a epítopos; melhor penetração tumoral e produção em sistemas procarióticos, diminuindo, assim, os custos de produção, para além da menor imunogenicidade. Neste contexto, para este projeto, explorámos o desenvolvimento de sdAbs específicos para o recetor HER2, conjugados com a toxina DT da bactéria Corynebacterium diphtheriae para desenvolver uma nova classe de imunotoxinas para o tratamento do cancro da mama HER2 positivo. As toxinas bacterianas que funcionam como fatores de virulência têm um grande potencial para desenvolver imunotoxinas. A toxina DT, produzida pela bactéria Corynebacterium diphtheriae, é uma potente exotoxina que tem sido explorada para desenvolver imunotoxinas, em que a entrada de uma única molécula numa célula pode ter efeitos letais. A utilização das propriedades citotóxicas é interessante, pois, quando conjugadas com um anticorpo que lhes fornece um alvo específico, tornamse moléculas muito promissoras. Para a construção da imunotoxina, o domínio de ligação da mesma é retirado e substituído por um anticorpo posteriormente combinado com o domínio catalítico que direciona e confere especificidade para que a toxina atue e passe a matar apenas as células cancerígenas. Assim, a imunotoxina que circula no organismo reconhece e se liga ao recetor é internalizada e, dentro da célula-alvo, liberta a molécula citotóxica, causando a morte celular através da inibição da síntese proteica. Nesse sentido, de forma a darmos seguimento ao nosso projecto, um coelho foi inicialmente imunizado com a proteína HER2. Em seguida, com o objectivo de validarmos se o coelho imunizados desenvolveu anticorpos específicos contra o alvo pretendido, a proteína HER2, o soro foi testado quer contra esta proteína, quer células de cancro de mama mantidas em cultura no laboratório (JIMT-1). Através dos ensaios levados a cabo, verificou-se que houve uma resposta imunitária eficiente e que, mesmo diluindo este soro 64000 vezes, continuávamos a ter anticorpos em circulação. Também através dos ensaios de ELISA, citometria de fluxo e imunofluorescência, percebemos que os anticorpos presentes no soro não só reconheciam a proteína HER2 na placa de ELISA como reconheciam o HER2 à superfície das células JIMT-1 como também tinham a capacidade de internalizar. Posteriormente, foi necessário selecionar os sdAbs, com maior afinidade/especificidade para o alvo pretendido. Para tal, foi utilizada uma biblioteca de fragmentos sdAbs VL, representativa do reportório de anticorpos produzidos pelo coelho aquando da sua imunização, que já se encontravam no vetor necessário, para proceder à seleção, o vetor pComb3x. Desse modo, procedeu-se à seleção pela técnica premiada em 2018 na área da microbiologia, o Phage display. Esta tecnologia baseia-se na engenharia genética de bacteriófagos e em várias rondas de seleção contra o antigénio e propagação dos fagos. Resumidamente, os fagos vão conter à sua superfície o fenótipo correspondente ao genótipo encapsulado no seu interior que contém a sequência correspondente aos fragmentos de ADN, obtidos através da construção das bibliotecas de anticorpos. Seguem-se várias rondas de seleção onde vão sendo eliminados os anticorpos-fagos que não se ligam ou que possuem uma fraca ligação ao antigénio, neste caso, a proteína HER2, através de várias lavagens. Estas rondas vão sendo repetidas até obtermos uma população de anticorpos específica para o alvo. O Phage display permitiu selecionar, a partir da biblioteca de sdAbs, três clones: o 4T, o 21T e o 12K. Após alguns estudos de caracterização, foi possível demonstrar que estes três clones de domínio único eram específicos para o recetor HER2 e eram promissores candidatos para prosseguir estudos adicionais. Estes clones foram sequenciados, permitindo determinar as famílias às quais eles pertenciam e perceber que eram, de facto, diferentes. Após esta seleção, os clones foram conjugados com a toxina DT, usando um vetor universal de expressão em sistema procariota. Foram obtidas colónias provenientes destas transformações de todas as ligações, no entanto, após confirmação da eficiência da clonagem por amplificação por PCR e, após extração do DNA, compreendeu-se que só poderíamos prosseguir com duas imunotoxinas, a 4TDT e a 21TDT. Por fim, foram realizados ensaios de caracterização das imunotoxinas. Procedeu-se à otimização da expressão de proteína e a avaliação da capacidade de ligação das mesmas ao recetor HER2 em placa de ELISA e, posteriormente, à expressão em larga escala (1 L) das mesmas. As abordagens e metodologias implementadas neste projeto foram importantes e determinantes, tendo levado ao desenvolvimento de duas imunotoxinas promissoras e candidatas a serem usadas como terapêuticas dirigidas ao cancro da mama HER2 positivo. No futuro, pretende-se realizar ensaios in vitro de citotoxicidade, citometria de fluxo e imunofluorescência em células JIMT-1 e células não cancerígenas, de forma a ser possível avaliar e caracterizar a atividade, estabilidade e o mecanismo das imunotoxinas desenvolvidas. Além disso, será também necessário efetuar estudos in vivo com as imunotoxinas em modelos de xenograft de cancro de mama em murganhos para ser avaliada a componente tóxica e a eficácia de ambas.
Autores principais:	Cargaleiro, Joana Cunha
Assunto:	Imunotoxina Cancro de Mama Receptor HER2 Anticorpos de dominio único (sdAbs) Toxina da Diphtheria (DT) Teses de mestrado - 2024
Ano:	2024
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O cancro continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo, sendo o cancro de mama o segundo tipo de cancro mais comum em todo o mundo. Cerca de uma em cada oito mulheres são diagnosticadas todos os anos. Em 2018, registaram-se perto de 2 milhões de novos casos de cancro de mama e ocorreram cerca de 630000 mortes derivadas à doença. Estima-se que este número aumente e que em 2025 se registem aproximadamente 2,5 milhões novos casos. O subtipo de cancro de mama Human Epidermal growth factor Receptor-type 2 (HER2) positivo é um dos mais agressivos e o recetor 2 do fator de crescimento epidérmico humano é um dos alvos mais explorados para o desenvolvimento de novas classes de anticorpos monoclonais e imunoterapias. O recetor HER2 encontra encontra-se expresso numa grande variedade de tumores e a sua sobre-expressão pode promover tumorigenese celular, fazendo com que células normais se tornem potenciais células cancerígenas. As terapias convencionais atuais no tratamento do cancro da mama apresentam bastantes objeções à sua utilização - a intervenção cirúrgica pode levar ao reaparecimento do tumor, devido à possibilidade de metástases locais; as doses necessárias para a quimioterapia são muito elevadas; a pouca especificidade no tratamento, dado que este também atua em células saudáveis do paciente; a existência de células resistentes a fármacos químicos e, por fim, a possibilidade de ocorrer a rádio resistência que é a resposta à reparação ao dano no ADN. Devido a todas estas adversidades, surgiu a imunoterapia que induz uma resposta imunitária contra o cancro e, mais recentemente, as terapias direcionadas que atuam não induzindo uma resposta imunológica como as imunoterapias, mas, sim, que direcionam fármacos ou toxinas ao alvo/antigénio desejado, sendo estas de vários tipos como os anticorpos monoclonais e os imunoconjugados, por exemplo. Estas moléculas são compostas por dois componentes, um anticorpo direcionado e específico para o alvo e, ligado a este, uma molécula citotóxica que mata as células cancerígenas. No entanto, apesar deste grande avanço, ainda existem obstáculos à utilização destas terapias contra o cancro - as resistências; a heterogeneidade tumoral; o acesso limitado às terapias; a falta de previsão na resposta imunitária do paciente e o elevado custo de produção, que limita a capacidade do seu desenvolvimento, levando a um aumento dos custos da terapia. Tanto os imunoconjugados como até mesmo o Trastuzumab (anticorpo monoclonal) usados na imunoterapia e nas terapias direcionadas que utilizam um anticorpo no seu tamanho convencional com reduzida penetração tumoral, impulsionou a grande procura para o desenvolvimento de formatos mais pequenos de anticorpos de domínio único (sdAbs). Os sdAb VL apresentam vantagens - melhor acesso a epítopos; melhor penetração tumoral e produção em sistemas procarióticos, diminuindo, assim, os custos de produção, para além da menor imunogenicidade. Neste contexto, para este projeto, explorámos o desenvolvimento de sdAbs específicos para o recetor HER2, conjugados com a toxina DT da bactéria Corynebacterium diphtheriae para desenvolver uma nova classe de imunotoxinas para o tratamento do cancro da mama HER2 positivo. As toxinas bacterianas que funcionam como fatores de virulência têm um grande potencial para desenvolver imunotoxinas. A toxina DT, produzida pela bactéria Corynebacterium diphtheriae, é uma potente exotoxina que tem sido explorada para desenvolver imunotoxinas, em que a entrada de uma única molécula numa célula pode ter efeitos letais. A utilização das propriedades citotóxicas é interessante, pois, quando conjugadas com um anticorpo que lhes fornece um alvo específico, tornamse moléculas muito promissoras. Para a construção da imunotoxina, o domínio de ligação da mesma é retirado e substituído por um anticorpo posteriormente combinado com o domínio catalítico que direciona e confere especificidade para que a toxina atue e passe a matar apenas as células cancerígenas. Assim, a imunotoxina que circula no organismo reconhece e se liga ao recetor é internalizada e, dentro da célula-alvo, liberta a molécula citotóxica, causando a morte celular através da inibição da síntese proteica. Nesse sentido, de forma a darmos seguimento ao nosso projecto, um coelho foi inicialmente imunizado com a proteína HER2. Em seguida, com o objectivo de validarmos se o coelho imunizados desenvolveu anticorpos específicos contra o alvo pretendido, a proteína HER2, o soro foi testado quer contra esta proteína, quer células de cancro de mama mantidas em cultura no laboratório (JIMT-1). Através dos ensaios levados a cabo, verificou-se que houve uma resposta imunitária eficiente e que, mesmo diluindo este soro 64000 vezes, continuávamos a ter anticorpos em circulação. Também através dos ensaios de ELISA, citometria de fluxo e imunofluorescência, percebemos que os anticorpos presentes no soro não só reconheciam a proteína HER2 na placa de ELISA como reconheciam o HER2 à superfície das células JIMT-1 como também tinham a capacidade de internalizar. Posteriormente, foi necessário selecionar os sdAbs, com maior afinidade/especificidade para o alvo pretendido. Para tal, foi utilizada uma biblioteca de fragmentos sdAbs VL, representativa do reportório de anticorpos produzidos pelo coelho aquando da sua imunização, que já se encontravam no vetor necessário, para proceder à seleção, o vetor pComb3x. Desse modo, procedeu-se à seleção pela técnica premiada em 2018 na área da microbiologia, o Phage display. Esta tecnologia baseia-se na engenharia genética de bacteriófagos e em várias rondas de seleção contra o antigénio e propagação dos fagos. Resumidamente, os fagos vão conter à sua superfície o fenótipo correspondente ao genótipo encapsulado no seu interior que contém a sequência correspondente aos fragmentos de ADN, obtidos através da construção das bibliotecas de anticorpos. Seguem-se várias rondas de seleção onde vão sendo eliminados os anticorpos-fagos que não se ligam ou que possuem uma fraca ligação ao antigénio, neste caso, a proteína HER2, através de várias lavagens. Estas rondas vão sendo repetidas até obtermos uma população de anticorpos específica para o alvo. O Phage display permitiu selecionar, a partir da biblioteca de sdAbs, três clones: o 4T, o 21T e o 12K. Após alguns estudos de caracterização, foi possível demonstrar que estes três clones de domínio único eram específicos para o recetor HER2 e eram promissores candidatos para prosseguir estudos adicionais. Estes clones foram sequenciados, permitindo determinar as famílias às quais eles pertenciam e perceber que eram, de facto, diferentes. Após esta seleção, os clones foram conjugados com a toxina DT, usando um vetor universal de expressão em sistema procariota. Foram obtidas colónias provenientes destas transformações de todas as ligações, no entanto, após confirmação da eficiência da clonagem por amplificação por PCR e, após extração do DNA, compreendeu-se que só poderíamos prosseguir com duas imunotoxinas, a 4TDT e a 21TDT. Por fim, foram realizados ensaios de caracterização das imunotoxinas. Procedeu-se à otimização da expressão de proteína e a avaliação da capacidade de ligação das mesmas ao recetor HER2 em placa de ELISA e, posteriormente, à expressão em larga escala (1 L) das mesmas. As abordagens e metodologias implementadas neste projeto foram importantes e determinantes, tendo levado ao desenvolvimento de duas imunotoxinas promissoras e candidatas a serem usadas como terapêuticas dirigidas ao cancro da mama HER2 positivo. No futuro, pretende-se realizar ensaios in vitro de citotoxicidade, citometria de fluxo e imunofluorescência em células JIMT-1 e células não cancerígenas, de forma a ser possível avaliar e caracterizar a atividade, estabilidade e o mecanismo das imunotoxinas desenvolvidas. Além disso, será também necessário efetuar estudos in vivo com as imunotoxinas em modelos de xenograft de cancro de mama em murganhos para ser avaliada a componente tóxica e a eficácia de ambas.