Publicação

Exploring the role of HoxA9 in IL7R-mediated B-cell leukemogenesis

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia hematológica mais prevalente em pacientes pediátricos e é caraterizada pela expansão anormal de linfócitos imaturos que começa na medula óssea, mas que se pode expandir para outros órgãos linfóides, bem como para órgãos não-linfóides. A leucemia linfoblástica aguda de células B (LLAB) resulta da proliferação aberrante de precursores de células B imaturos e é o subtipo de LLA mais predominante, constituindo cerca de 80% dos casos de LLA. É uma realidade que as terapias são altamente eficazes, no entanto, apesar da grande taxa de sucesso, ainda existe um número significativo de casos que sofrem recaídas e que notam os efeitos secundários a longo prazo provenientes dos regimes de quimioterapias intensas. Por isso, a investigação das causas moleculares da LLA é necessária para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas mais direcionadas e individualizadas para cada paciente. A sinalização mediada pela ligação da interleucina-7 (IL-7), produzida por células estromais, ao seu recetor (IL-7R), expresso nas células B e T, é essencial para a sobrevivência, proliferação e manutenção do compartimento linfóide. O recetor da IL-7 é um heterodímero constituído por duas subunidades, a cadeia alfa (IL-7Rα) e a cadeia gama comum (γc). Quando ocorre a ligação da IL-7 ao IL-7R, as duas subunidades heterodimerizam e ativam várias vias de sinalização, promovendo aumento da viabilidade e progressão do ciclo celular. JAK/STAT, PI3K/AKT e MEK/ERK são as principais vias ativadas pelo eixo IL-7/IL-7R. No passado, o nosso laboratório descreveu mutações somáticas com ganho de função no exão 6 do gene IL7R (que codifica para a IL-7Rα) que ocorrem em 9% dos casos de LLA-T e que são também conhecidas por estarem enriquecidas nos subgrupos Ph-like e PAX5P80R de LLA-B. Estas mutações são caraterizadas pela inserção de cisteínas desemparelhadas na região justamembranar extracelular do IL-7Rα que promove a junção e homodimerização de duas subunidades IL-7Rα através de ligações dissulfeto. O IL-7Rα mutado promove a ativação dum sinal constitutivo que é independente da γc, da JAK3 e da própria IL-7. Recentemente, o nosso laboratório gerou e caraterizou um modelo de ratinho knock in condicional em que o IL7R mutado é expresso apenas em células linfoides, que desenvolve leucemia B semelhante aos subtipos PAX5P80R e Ph-like presentes em doentes com LLA de células B. Através da sequenciação de RNA (por next-generation sequencing) realizada em células da medula óssea provenientes destas leucemias foi encontrado que os níveis de HoxA9 e outros membros da família Hoxa estavam subexpressos em células leucémicas quando comparados com precursores normais de células B. De acordo, alguns genes que são normalmente regulados positivamente por HoxA9 também estavam subexpressos. Este facto ganha particular relevância sabendo que o gene em causa, HoxA9, é um interveniente importante no processo de expansão hematopoiética e na linfopoiese de células B. Acresce que a literatura no contexto de neoplasias hematológicas descreve HoxA9 maioritariamente como estando sobreexpresso e/ou atuando como um oncogene, nomeadamente em LLA-B com rearranjo do gene MLL, em LLA-T e emleucemia mieloide aguda. Tendo em conta estes factos, foi com surpresa que observámos que o HoxA9 está subexpresso não apenas no modelo de ratinho desenvolvido pelo nosso laboratório, mas também em subtipos de LLA-B humana conhecidos por terem uma frequência aumentada de mutações do IL7R (os já referidos subtipos PAX5P80R e Ph-like), bem como em vários outros subtipos de LLA-B (com a exceção dos casos com rearranjo de MLL ou dos casos MLL-like, que apresentam sobreexpressão de HOXA9). Estas observações sugerem que o HOXA9 poderá ter um papel de supressor tumoral em diferentes tipos de LLA-B, incluindo aqueles com IL7R mutado. Em apoio desta hipótese, dados preliminares resultantes da análise de células leucémicas do nosso modelo condicional de ratinho, que foram transduzidas com um vetor de retrovírus sobreexpressando o Hoxa9, demonstraram uma redução na proliferação e viabilidade em comparação com as células leucémicas que foram transduzidas com o vetor vazio. O efeito da sobreexpressão do Hoxa9 nas células leucémicas acabou também por resultar num aumento do tempo máximo de vida dos hospedeiros imunodeficientes nos quais estas foram injetadas em comparação com aqueles que foram injetadas com células contendo o vetor vazio. Isto sugere que as leucemias resultantes do modelo animal gerado no nosso laboratório beneficiam de baixos níveis de Hoxa9 que lhes proporciona uma vantagem seletiva. Assim, para compreender e caraterizar melhor o papel do Hoxa9 nas leucemias induzidas pela mutação do IL7R com um fenótipo de PAXP80R ou Ph-like, nesta dissertação, demos os passos iniciais para avaliar o impacto da diminuição dos níveis de Hoxa9 no desenvolvimento destas leucemias. Adicionalmente, tentámos compreender se a diminuição de expressão de Hoxa9 nas células leucémicas se deve, pelo menos em parte, a mecanismos de regulação epigenética. Para isso, analisámos o impacto dum inibidor de histonas deacetilases (Vorinostat - SAHA) e um inibidor de ADN metiltransferases (Azacitidina - AZA) nos níveis de mRNA do Hoxa9. Considerando a possibilidade de o HoxA9 estar a atuar como um supressor tumoral em LLA-B mediada pelo IL7R mutante, pretendemos avaliar os impactos da subexpressão dos níveis de Hoxa9 ao nível do desenvolvimento destas leucemias. Para este propósito, células pré-leucémicas da medula óssea do nosso modelo animal foram isoladas e transduzidas com recurso a vectores lentivirais contendo shRNAs que permitem diminuir Hoxa9. As células transduzidas foram depois injetadas em ratinhos imunodeficientes irradiados letalmente, os quais estão de momento a ser monitorizados. A avaliação destes animais consiste na análise da repopulação do compartimento linfóide com as células transduzidas e do tempo que leva até ao desenvolvimento da leucemia. Se a nossa hipótese estiver certa, esperamos que a diminuição dos níveis de expressão do Hoxa9 ao nível das células pré-leucémicas do nosso modelo animal contribua para um aumento da viabilidade e proliferação das células e que, consequentemente, haja uma aceleração do desenvolvimento da leucemia. Um segundo aspeto dos nossos resultados consistiu em analisar o impacto da sobreexpressão do Hoxa9 nas vias de sinalização mediadas pelo IL7R. Para isso, com recurso a células leucémicas do nosso modelo animal previamente transduzidas com o vetor de sobreexpressão do Hoxa9 e com o vetor vazio, foi demonstrado por Western Blot que, a nível molecular, os efeitos da sobreexpressão deste gene na via da IL-7 estão associados a uma redução da sinalização da via do PI3K/AKT/mTOR, uma das vias aberrantemente ativadas pela mutação do IL-7Rα. Em detalhe, observamos uma menor expressão de AKT e S6 fosforilado nas células que foram transduzidas com o vetor de sobreexpressão do Hoxa9 quando comparadas com aquelas transduzidas com o vetor vazio. Estes resultados sugerem que a expressão de Hoxa9 regula negativamente a atividade da via PI3K/AKT/mTOR (que está usualmente associada a aumento de viabilidade e proliferação). Finalmente, com intuito de avaliar o possível silenciamento epigenético do Hoxa9 nas leucemias do nosso modelo animal, avançámos a hipótese de que a sua expressão está sob o controlo repressivo envolvendo mecanismos de acetilação ou metilação. O tratamento das células leucémicas do nosso modelo animal com SAHA e AZA permitiu-nos concluir que um dos mecanismos envolvidos na regulação do Hoxa9 nas LLA-B está relacionado com histonas deacetilases, já que após o tratamento com SAHA existe um aumento significativo dos níveis do transcrito do Hoxa9 analisados por RT-qPCR. Em relação aos estudos de metilação, não foi encontrado um impacto significativo nos níveis do Hoxa9 após o tratamento com AZA. Em suma, os nossos resultados sugerem que a diminuição da expressão de Hoxa9 nas células de LLA-B deve passar, pelo menos em parte, pela inibição epigenética do gene envolvendo a regulação do nível de acetilação de histonas.
Autores principais:	Gama, Sara Alexandra Barros da
Assunto:	HoxA9 Recetor da Interleucina-7 (IL-7R) Leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) Regulação epigenética Teses de mestrado - 2022
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia hematológica mais prevalente em pacientes pediátricos e é caraterizada pela expansão anormal de linfócitos imaturos que começa na medula óssea, mas que se pode expandir para outros órgãos linfóides, bem como para órgãos não-linfóides. A leucemia linfoblástica aguda de células B (LLAB) resulta da proliferação aberrante de precursores de células B imaturos e é o subtipo de LLA mais predominante, constituindo cerca de 80% dos casos de LLA. É uma realidade que as terapias são altamente eficazes, no entanto, apesar da grande taxa de sucesso, ainda existe um número significativo de casos que sofrem recaídas e que notam os efeitos secundários a longo prazo provenientes dos regimes de quimioterapias intensas. Por isso, a investigação das causas moleculares da LLA é necessária para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas mais direcionadas e individualizadas para cada paciente. A sinalização mediada pela ligação da interleucina-7 (IL-7), produzida por células estromais, ao seu recetor (IL-7R), expresso nas células B e T, é essencial para a sobrevivência, proliferação e manutenção do compartimento linfóide. O recetor da IL-7 é um heterodímero constituído por duas subunidades, a cadeia alfa (IL-7Rα) e a cadeia gama comum (γc). Quando ocorre a ligação da IL-7 ao IL-7R, as duas subunidades heterodimerizam e ativam várias vias de sinalização, promovendo aumento da viabilidade e progressão do ciclo celular. JAK/STAT, PI3K/AKT e MEK/ERK são as principais vias ativadas pelo eixo IL-7/IL-7R. No passado, o nosso laboratório descreveu mutações somáticas com ganho de função no exão 6 do gene IL7R (que codifica para a IL-7Rα) que ocorrem em 9% dos casos de LLA-T e que são também conhecidas por estarem enriquecidas nos subgrupos Ph-like e PAX5P80R de LLA-B. Estas mutações são caraterizadas pela inserção de cisteínas desemparelhadas na região justamembranar extracelular do IL-7Rα que promove a junção e homodimerização de duas subunidades IL-7Rα através de ligações dissulfeto. O IL-7Rα mutado promove a ativação dum sinal constitutivo que é independente da γc, da JAK3 e da própria IL-7. Recentemente, o nosso laboratório gerou e caraterizou um modelo de ratinho knock in condicional em que o IL7R mutado é expresso apenas em células linfoides, que desenvolve leucemia B semelhante aos subtipos PAX5P80R e Ph-like presentes em doentes com LLA de células B. Através da sequenciação de RNA (por next-generation sequencing) realizada em células da medula óssea provenientes destas leucemias foi encontrado que os níveis de HoxA9 e outros membros da família Hoxa estavam subexpressos em células leucémicas quando comparados com precursores normais de células B. De acordo, alguns genes que são normalmente regulados positivamente por HoxA9 também estavam subexpressos. Este facto ganha particular relevância sabendo que o gene em causa, HoxA9, é um interveniente importante no processo de expansão hematopoiética e na linfopoiese de células B. Acresce que a literatura no contexto de neoplasias hematológicas descreve HoxA9 maioritariamente como estando sobreexpresso e/ou atuando como um oncogene, nomeadamente em LLA-B com rearranjo do gene MLL, em LLA-T e emleucemia mieloide aguda. Tendo em conta estes factos, foi com surpresa que observámos que o HoxA9 está subexpresso não apenas no modelo de ratinho desenvolvido pelo nosso laboratório, mas também em subtipos de LLA-B humana conhecidos por terem uma frequência aumentada de mutações do IL7R (os já referidos subtipos PAX5P80R e Ph-like), bem como em vários outros subtipos de LLA-B (com a exceção dos casos com rearranjo de MLL ou dos casos MLL-like, que apresentam sobreexpressão de HOXA9). Estas observações sugerem que o HOXA9 poderá ter um papel de supressor tumoral em diferentes tipos de LLA-B, incluindo aqueles com IL7R mutado. Em apoio desta hipótese, dados preliminares resultantes da análise de células leucémicas do nosso modelo condicional de ratinho, que foram transduzidas com um vetor de retrovírus sobreexpressando o Hoxa9, demonstraram uma redução na proliferação e viabilidade em comparação com as células leucémicas que foram transduzidas com o vetor vazio. O efeito da sobreexpressão do Hoxa9 nas células leucémicas acabou também por resultar num aumento do tempo máximo de vida dos hospedeiros imunodeficientes nos quais estas foram injetadas em comparação com aqueles que foram injetadas com células contendo o vetor vazio. Isto sugere que as leucemias resultantes do modelo animal gerado no nosso laboratório beneficiam de baixos níveis de Hoxa9 que lhes proporciona uma vantagem seletiva. Assim, para compreender e caraterizar melhor o papel do Hoxa9 nas leucemias induzidas pela mutação do IL7R com um fenótipo de PAXP80R ou Ph-like, nesta dissertação, demos os passos iniciais para avaliar o impacto da diminuição dos níveis de Hoxa9 no desenvolvimento destas leucemias. Adicionalmente, tentámos compreender se a diminuição de expressão de Hoxa9 nas células leucémicas se deve, pelo menos em parte, a mecanismos de regulação epigenética. Para isso, analisámos o impacto dum inibidor de histonas deacetilases (Vorinostat - SAHA) e um inibidor de ADN metiltransferases (Azacitidina - AZA) nos níveis de mRNA do Hoxa9. Considerando a possibilidade de o HoxA9 estar a atuar como um supressor tumoral em LLA-B mediada pelo IL7R mutante, pretendemos avaliar os impactos da subexpressão dos níveis de Hoxa9 ao nível do desenvolvimento destas leucemias. Para este propósito, células pré-leucémicas da medula óssea do nosso modelo animal foram isoladas e transduzidas com recurso a vectores lentivirais contendo shRNAs que permitem diminuir Hoxa9. As células transduzidas foram depois injetadas em ratinhos imunodeficientes irradiados letalmente, os quais estão de momento a ser monitorizados. A avaliação destes animais consiste na análise da repopulação do compartimento linfóide com as células transduzidas e do tempo que leva até ao desenvolvimento da leucemia. Se a nossa hipótese estiver certa, esperamos que a diminuição dos níveis de expressão do Hoxa9 ao nível das células pré-leucémicas do nosso modelo animal contribua para um aumento da viabilidade e proliferação das células e que, consequentemente, haja uma aceleração do desenvolvimento da leucemia. Um segundo aspeto dos nossos resultados consistiu em analisar o impacto da sobreexpressão do Hoxa9 nas vias de sinalização mediadas pelo IL7R. Para isso, com recurso a células leucémicas do nosso modelo animal previamente transduzidas com o vetor de sobreexpressão do Hoxa9 e com o vetor vazio, foi demonstrado por Western Blot que, a nível molecular, os efeitos da sobreexpressão deste gene na via da IL-7 estão associados a uma redução da sinalização da via do PI3K/AKT/mTOR, uma das vias aberrantemente ativadas pela mutação do IL-7Rα. Em detalhe, observamos uma menor expressão de AKT e S6 fosforilado nas células que foram transduzidas com o vetor de sobreexpressão do Hoxa9 quando comparadas com aquelas transduzidas com o vetor vazio. Estes resultados sugerem que a expressão de Hoxa9 regula negativamente a atividade da via PI3K/AKT/mTOR (que está usualmente associada a aumento de viabilidade e proliferação). Finalmente, com intuito de avaliar o possível silenciamento epigenético do Hoxa9 nas leucemias do nosso modelo animal, avançámos a hipótese de que a sua expressão está sob o controlo repressivo envolvendo mecanismos de acetilação ou metilação. O tratamento das células leucémicas do nosso modelo animal com SAHA e AZA permitiu-nos concluir que um dos mecanismos envolvidos na regulação do Hoxa9 nas LLA-B está relacionado com histonas deacetilases, já que após o tratamento com SAHA existe um aumento significativo dos níveis do transcrito do Hoxa9 analisados por RT-qPCR. Em relação aos estudos de metilação, não foi encontrado um impacto significativo nos níveis do Hoxa9 após o tratamento com AZA. Em suma, os nossos resultados sugerem que a diminuição da expressão de Hoxa9 nas células de LLA-B deve passar, pelo menos em parte, pela inibição epigenética do gene envolvendo a regulação do nível de acetilação de histonas.