Publicação

Unveilling the interplay between activated astrocytes and neurons in an in vitro model of alzheimer’s disease

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Nas últimas décadas, o aumento demográfico da população com 65 ou mais anos tem vindo a traduzir-se num aumento da prevalência de doenças associadas à idade. Atualmente, a Doença de Alzheimer (DA) representa um dos maiores problemas de saúde do século XXI, sendo considerada a forma mais comum de demência (60-80%) entre esta população. De acordo com dados recentes, mais de 50 milhões de indivíduos à escala mundial são afetados por esta patologia, estimando-se uma duplicação deste valor a cada 20 anos. Perante um crescimento tão acelerado, em 2050 prevê-se que um total de 131.5 milhões de casos seja atingido, sendo esperado o diagnóstico de um novo caso a cada 3.2 segundos. De facto, com números tão dramáticos, a procura de um diagnóstico preciso e tratamento eficaz na prevenção da doença, ou pelo menos da sua progressão, assume um carácter de urgência a nível da intervenção em saúde e tornou-se uma prioridade no combate a esta patologia, dado o seu elevado impacto socio-económico. Até à presente data, apenas quatro agentes terapêuticos para a DA mereceram a aprovação da Agência Europeia do Medicamento. No entanto, apesar de atrasarem a progressão do declínio cognitivo associado à mesma, nenhum destes fármacos apresenta a capacidade de travar o processo neurodegenerativo de um modo eficiente, evidenciando a necessidade de desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Em termos patofisiológicos, a DA é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela deposição extracelular do péptido β-amilóide e acumulação intraneuronal de emaranhados neurofibrilares, que resultam numa massiva perda de neurónios e dos contactos sinápticos, envolvidos na formação de memória e no desenvolvimento de capacidades cognitivas. Para além destas características, a neuroinflamação surge também como uma importante componente patológica que contribui para a progressão e exacerbação da doença, justificando possivelmente a heterogeneidade clínica observada entre os diferentes doentes. Apesar do seu evidente envolvimento nesta patologia ainda não é, no entanto, totalmente compreendido se a neuroinflamação surge como causa ou consequência da neurodegeneração, não sendo pois claros quais os mecanismos envolvidos neste processo. Na DA, a reação inflamatória ocorre nas regiões cerebrais afetadas pela doença e é atribuída maioritariamente às células imunitárias residentes no Sistema Nervoso Central (SNC), nomeadamente a microglia e as células mielóides perivasculares. As células microgliais são consideradas os macrófagos residentes do cérebro, apresentando-se em condições fisiológicas num estado de vigilância designado por M0, à luz do referido para os macrófagos. Perante alterações da homeostase do SNC, as células microgliais tornam-se ativadas, podendo adquirir o perfil M1 pro-inflamatório, que está geralmente associado à libertação de mediadores promotores do processo de inflamação. Apesar de as células da microglia serem consideradas as principais mediadoras desta resposta neuroinflamatória, sabe-se também que os astrócitos desempenham funções igualmente importantes como mediadores da neuroinflamação. Tal como a microglia, os astrócitos têm a capacidade de responder a diferentes tipos de estímulos que podem ocorrer no SNC e afetar o seu normal funcionamento. Geralmente, esta capacidade de resposta é acompanhada por algumas alterações nas próprias células, quer na sua morfologia, quer em aspetos relativos aos processos de transcrição, que acabam por influenciar a sua funcionalidade. Para além disso, os astrócitos, tal como outras células, têm a capacidade de libertar vesículas extracelulares (VEs) como forma de comunicação intercelular. Num contexto neuroinflamatório, as células astrogliais podem secretar pequenas VEs (pEVs) contendo microRNAs (miRNAs) capazes de modular a resposta inflamatória por parte de outras células e também afetar as suas funções. Apesar destas evidências, a população astroglial permanece ainda pouco investigada, sendo necessário um maior número de estudos para esclarecer quais os mecanismos envolvidos na resposta inflamatória mediada pelos astrócitos e de que forma a neuroinflamação de facto contribui para a neurodegeneração presente na DA. Recentemente foi descrito que, quando incubados com fatores solúveis (TNF-α, IL-1β e C1q) derivados da microglia ativada em estado M1 pro-inflamatório, os astrócitos são capazes de adquirir um fenótipo de ativação A1, com propriedades neurotóxicas cruciais para a progressão da patologia. Apesar de ter sido mostrado que os astrócitos A1 representam uma grande proporção de astrócitos na DA, ainda não é claro quais os mecanismos envolvidos na neurotoxicidade provocada por este tipo de células, principalmente devido à escassez de plataformas biológicas experimentais eficientes no estudo da função glial no contexto da doença. Neste trabalho usámos a linha celular glial fetal 10B1 e as células neuronais humanas SH-SY5Y (SH) transfetadas com a mutação Swedish APP695 (SHSwe), de modo a avaliar o seguinte: 1.As alterações no fenótipo dos astrócitos 10B1 após ativação em A1 (10B1A1) relativas à morfologia celular, expressão de mediadores inflamatórios, bem como de miRNAs comumente associados à neuroinflamação, quer nas células, quer nas pVEs; 2. Os efeitos causados pela co-cultura das células 10B1A1/SHSwe no fenótipo dos astrócitos, nomeadamente no seu perfil inflamatório, bem como dos mesmos miRNAs nos astrócitos activados e suas pVEs; e 3. O impacto provocado pela co-cultura 10B1A1/SHSwe na disfunção neuronal, nomeadamente no comprimento das neurites, seu perfil inflamatório, bem como a expressão de miRNAs nas células e pVEs. A ativação A1 nos astrócitos 10B1 levou a um aumento da expressão de GFAP e hipertrofia às 24 h de incubação. Para além disso, observou-se ainda uma elevada expressão inicial dos genes TNF-α e IL-10 (4 h), tal como dos miRNA-155, miRNA-146a e miRNA-124. A ativação A1, diminuiu ainda a expressão do miRNA-124 nas pVEs derivadas dos astrócitos 10B1A1, indicando a sua acumulação a nível celular. A seguir, analisou-se de que forma esse fenótipo era positivamente ou negativamente regulado pela presença dos neurónios SHSwe relativamente às células SH não mutadas. Não se verificaram alterações na viabilidade dos astrócitos, mas as células adquiriram uma morfologia mais arredondada, diminuindo o número de células com aparência de fibroblastos, quando incubadas na presença dos neurónios SHSwe. Também demonstraram uma tendência para aumentar a expressão génica de TNF-α e foram capazes de reduzir marcadamente a expressão génica de IL-10, menos nas células expostas aos neurónios mutados, se comparadas com os astrócitos incubados em monocultura. Quando aferidos à co cultura com SH, os astrócitos 10B1A1 expostos aos neurónios SHSwe apresentaram um aumento de expressão do gene da IL-10, bem como de miRNA -155, miRNA-146a e miRNA-125b. Semelhante ao observado com a ativação nos astrócitos, observámos agora uma retenção intracelular de miRNA-155, que levou à sua diminuição nas pVEs comparativamente ao observado nas pVEs das co-culturas com SH. Passando agora para o efeito que os astrócitos ativados podem causar nos neurónios SHSwe, detetámos uma redução do comprimento das suas neurites, a qual não foi observada nas coculturas com os neurónios não mutados. Para além disso, os astrócitos 10B1A1 não alteraram a expressão do gene da IL-10 nas células SHSwe, mas aumentaram os níveis do gene da TNF-α de uma forma marcada quando os resultados foram comparados aos obtidos nas coculturas com os neurónios SH. Nestas, curiosamente, a exposição aos astrócitos 10B1A1 até diminuiu tal expressão. Verificámos ainda que os astrócitos activados são capazes de elevar a expressão de miRNA-155, miRNA-146a, miRNA-124, miRNA-125b e miRNA-21, causando uma marcada desregulação, também mantida nas células mutadas, mas não atingindo significância estatística em resultado de menor reprodutibilidade experimental no trabalho com as células SHSwe. O facto de, até ao momento, ainda não existirem terapias eficazes no tratamento da DA deve se, em parte, à utilização de modelos experimentais que não recapitulam na sua plenitude os mecanismos patológicos que caracterizam a doença no ser humano. A grande maioria dos modelos utilizados para explorar o papel dos astrócitos na DA são baseados em modelos animais. No entanto, apesar das suas vantagens, estes modelos apresentam alguns problemas derivados das diferenças específicas entre espécies, o que reforça a necessidade de modelos mais representativos e aproximados à biologia humana que permitam abordar estratégias terapêuticas mais adequadas e eficazes. Concluindo, o nosso modelo in vitro da DA, usando co-cultura de células humanas, reflete algumas das características observadas na doença e fornece um novo conhecimento sobre o papel dos astrócitos ativados em A1 nos processos neuroinflamatórios e neurodegenerativos que ocorrem na patologia, apresentando uma boa oportunidade para explorar de uma forma mais aprofundada o modo como a comunicação neurónios-glia está envolvida na doença.
Autores principais:	Moreira, Ana Filipa da Costa
Assunto:	Alzheimers´ disease A1 Astrocytes Inflammatory miRNAS Neuroinflammation Neuron-Astrocytes Signaling Teses de mestrado - 2019
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Nas últimas décadas, o aumento demográfico da população com 65 ou mais anos tem vindo a traduzir-se num aumento da prevalência de doenças associadas à idade. Atualmente, a Doença de Alzheimer (DA) representa um dos maiores problemas de saúde do século XXI, sendo considerada a forma mais comum de demência (60-80%) entre esta população. De acordo com dados recentes, mais de 50 milhões de indivíduos à escala mundial são afetados por esta patologia, estimando-se uma duplicação deste valor a cada 20 anos. Perante um crescimento tão acelerado, em 2050 prevê-se que um total de 131.5 milhões de casos seja atingido, sendo esperado o diagnóstico de um novo caso a cada 3.2 segundos. De facto, com números tão dramáticos, a procura de um diagnóstico preciso e tratamento eficaz na prevenção da doença, ou pelo menos da sua progressão, assume um carácter de urgência a nível da intervenção em saúde e tornou-se uma prioridade no combate a esta patologia, dado o seu elevado impacto socio-económico. Até à presente data, apenas quatro agentes terapêuticos para a DA mereceram a aprovação da Agência Europeia do Medicamento. No entanto, apesar de atrasarem a progressão do declínio cognitivo associado à mesma, nenhum destes fármacos apresenta a capacidade de travar o processo neurodegenerativo de um modo eficiente, evidenciando a necessidade de desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Em termos patofisiológicos, a DA é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela deposição extracelular do péptido β-amilóide e acumulação intraneuronal de emaranhados neurofibrilares, que resultam numa massiva perda de neurónios e dos contactos sinápticos, envolvidos na formação de memória e no desenvolvimento de capacidades cognitivas. Para além destas características, a neuroinflamação surge também como uma importante componente patológica que contribui para a progressão e exacerbação da doença, justificando possivelmente a heterogeneidade clínica observada entre os diferentes doentes. Apesar do seu evidente envolvimento nesta patologia ainda não é, no entanto, totalmente compreendido se a neuroinflamação surge como causa ou consequência da neurodegeneração, não sendo pois claros quais os mecanismos envolvidos neste processo. Na DA, a reação inflamatória ocorre nas regiões cerebrais afetadas pela doença e é atribuída maioritariamente às células imunitárias residentes no Sistema Nervoso Central (SNC), nomeadamente a microglia e as células mielóides perivasculares. As células microgliais são consideradas os macrófagos residentes do cérebro, apresentando-se em condições fisiológicas num estado de vigilância designado por M0, à luz do referido para os macrófagos. Perante alterações da homeostase do SNC, as células microgliais tornam-se ativadas, podendo adquirir o perfil M1 pro-inflamatório, que está geralmente associado à libertação de mediadores promotores do processo de inflamação. Apesar de as células da microglia serem consideradas as principais mediadoras desta resposta neuroinflamatória, sabe-se também que os astrócitos desempenham funções igualmente importantes como mediadores da neuroinflamação. Tal como a microglia, os astrócitos têm a capacidade de responder a diferentes tipos de estímulos que podem ocorrer no SNC e afetar o seu normal funcionamento. Geralmente, esta capacidade de resposta é acompanhada por algumas alterações nas próprias células, quer na sua morfologia, quer em aspetos relativos aos processos de transcrição, que acabam por influenciar a sua funcionalidade. Para além disso, os astrócitos, tal como outras células, têm a capacidade de libertar vesículas extracelulares (VEs) como forma de comunicação intercelular. Num contexto neuroinflamatório, as células astrogliais podem secretar pequenas VEs (pEVs) contendo microRNAs (miRNAs) capazes de modular a resposta inflamatória por parte de outras células e também afetar as suas funções. Apesar destas evidências, a população astroglial permanece ainda pouco investigada, sendo necessário um maior número de estudos para esclarecer quais os mecanismos envolvidos na resposta inflamatória mediada pelos astrócitos e de que forma a neuroinflamação de facto contribui para a neurodegeneração presente na DA. Recentemente foi descrito que, quando incubados com fatores solúveis (TNF-α, IL-1β e C1q) derivados da microglia ativada em estado M1 pro-inflamatório, os astrócitos são capazes de adquirir um fenótipo de ativação A1, com propriedades neurotóxicas cruciais para a progressão da patologia. Apesar de ter sido mostrado que os astrócitos A1 representam uma grande proporção de astrócitos na DA, ainda não é claro quais os mecanismos envolvidos na neurotoxicidade provocada por este tipo de células, principalmente devido à escassez de plataformas biológicas experimentais eficientes no estudo da função glial no contexto da doença. Neste trabalho usámos a linha celular glial fetal 10B1 e as células neuronais humanas SH-SY5Y (SH) transfetadas com a mutação Swedish APP695 (SHSwe), de modo a avaliar o seguinte: 1.As alterações no fenótipo dos astrócitos 10B1 após ativação em A1 (10B1A1) relativas à morfologia celular, expressão de mediadores inflamatórios, bem como de miRNAs comumente associados à neuroinflamação, quer nas células, quer nas pVEs; 2. Os efeitos causados pela co-cultura das células 10B1A1/SHSwe no fenótipo dos astrócitos, nomeadamente no seu perfil inflamatório, bem como dos mesmos miRNAs nos astrócitos activados e suas pVEs; e 3. O impacto provocado pela co-cultura 10B1A1/SHSwe na disfunção neuronal, nomeadamente no comprimento das neurites, seu perfil inflamatório, bem como a expressão de miRNAs nas células e pVEs. A ativação A1 nos astrócitos 10B1 levou a um aumento da expressão de GFAP e hipertrofia às 24 h de incubação. Para além disso, observou-se ainda uma elevada expressão inicial dos genes TNF-α e IL-10 (4 h), tal como dos miRNA-155, miRNA-146a e miRNA-124. A ativação A1, diminuiu ainda a expressão do miRNA-124 nas pVEs derivadas dos astrócitos 10B1A1, indicando a sua acumulação a nível celular. A seguir, analisou-se de que forma esse fenótipo era positivamente ou negativamente regulado pela presença dos neurónios SHSwe relativamente às células SH não mutadas. Não se verificaram alterações na viabilidade dos astrócitos, mas as células adquiriram uma morfologia mais arredondada, diminuindo o número de células com aparência de fibroblastos, quando incubadas na presença dos neurónios SHSwe. Também demonstraram uma tendência para aumentar a expressão génica de TNF-α e foram capazes de reduzir marcadamente a expressão génica de IL-10, menos nas células expostas aos neurónios mutados, se comparadas com os astrócitos incubados em monocultura. Quando aferidos à co cultura com SH, os astrócitos 10B1A1 expostos aos neurónios SHSwe apresentaram um aumento de expressão do gene da IL-10, bem como de miRNA -155, miRNA-146a e miRNA-125b. Semelhante ao observado com a ativação nos astrócitos, observámos agora uma retenção intracelular de miRNA-155, que levou à sua diminuição nas pVEs comparativamente ao observado nas pVEs das co-culturas com SH. Passando agora para o efeito que os astrócitos ativados podem causar nos neurónios SHSwe, detetámos uma redução do comprimento das suas neurites, a qual não foi observada nas coculturas com os neurónios não mutados. Para além disso, os astrócitos 10B1A1 não alteraram a expressão do gene da IL-10 nas células SHSwe, mas aumentaram os níveis do gene da TNF-α de uma forma marcada quando os resultados foram comparados aos obtidos nas coculturas com os neurónios SH. Nestas, curiosamente, a exposição aos astrócitos 10B1A1 até diminuiu tal expressão. Verificámos ainda que os astrócitos activados são capazes de elevar a expressão de miRNA-155, miRNA-146a, miRNA-124, miRNA-125b e miRNA-21, causando uma marcada desregulação, também mantida nas células mutadas, mas não atingindo significância estatística em resultado de menor reprodutibilidade experimental no trabalho com as células SHSwe. O facto de, até ao momento, ainda não existirem terapias eficazes no tratamento da DA deve se, em parte, à utilização de modelos experimentais que não recapitulam na sua plenitude os mecanismos patológicos que caracterizam a doença no ser humano. A grande maioria dos modelos utilizados para explorar o papel dos astrócitos na DA são baseados em modelos animais. No entanto, apesar das suas vantagens, estes modelos apresentam alguns problemas derivados das diferenças específicas entre espécies, o que reforça a necessidade de modelos mais representativos e aproximados à biologia humana que permitam abordar estratégias terapêuticas mais adequadas e eficazes. Concluindo, o nosso modelo in vitro da DA, usando co-cultura de células humanas, reflete algumas das características observadas na doença e fornece um novo conhecimento sobre o papel dos astrócitos ativados em A1 nos processos neuroinflamatórios e neurodegenerativos que ocorrem na patologia, apresentando uma boa oportunidade para explorar de uma forma mais aprofundada o modo como a comunicação neurónios-glia está envolvida na doença.